Summary
यहाँ, हम सीधे माउस ओर्टा के एंडोथेलियल कोशिकाओं का निरीक्षण करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। यह तकनीक उपयोगी है जब विभिन्न प्रवाह पैटर्न में endothelial कोशिकाओं के सेलुलर और आणविक phenotype का अध्ययन और atherosclerosis के विकास में.
Abstract
एंडोथेलियल फीनोटाइप और आकृति विज्ञान में एथेरोस्क्लेरोसिस के रोगजनन में प्रारंभिक घटनाओं के रूप में एबरेंट परिवर्तन माना जाता है। बरकरार endothelium के प्रत्यक्ष अवलोकन बेकार endothelial कोशिकाओं में सेलुलर और आणविक घटनाओं को समझने के लिए बहुमूल्य जानकारी प्रदान करेगा. यहाँ, हम एक संशोधित एन चेहरे इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला तकनीक का वर्णन करते हैं जो वैज्ञानिकों को बरकरार एंडोथेलियल सतह की स्पष्ट छवियों को प्राप्त करने और स्थिति में अणु अभिव्यक्ति पैटर्न का विश्लेषण करने में सक्षम बनाता है। विधि aorta के विभिन्न स्थलों पर पूरे endothelial मोनोलेयर देखने के लिए सरल और विश्वसनीय है. इस तकनीक atherosclerosis के pathophysiology को समझने के लिए एक आशाजनक उपकरण हो सकता है, विशेष रूप से एक प्रारंभिक चरण में.
Introduction
वास्कुलेचर में प्रारंभिक परिवर्तन मुख्य रूप से एंडोथेलियम में आरंभ होता है, जो रक्त और पोत की दीवार के बीच एक चयनात्मक अवरोध के रूप में कार्य करता है जिसमें इसके अंतरकोशिकीय तंग जंक्शनल परिसर1होते हैं। पर्याप्त साक्ष्य अंत:प्रवर्तक फलन2में रक्त प्रवाह के यांत्रिक प्रभावों के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका की ओर संकेत करते हैं . द्रव कतरनी तनाव, रक्त प्रवाह द्वारा उत्पन्न एक घर्षण बल, अंतर आकार endothelial सेल आकृति विज्ञान और समारोह, विभिन्न संवहनी स्थलों पर विशिष्ट प्रवाह प्रतिमानों पर निर्भर करता है2,3. एथेरोस्क्लेरोटिक घाव परेशान रक्त प्रवाह (डी-प्रवाह) के स्थलों पर वरीयता से पाए जाते हैं, जैसे पोत वक्रता, प्रवाह डिवाइडर, और शाखा बिंदु, स्थिर प्रवाह (एस-प्रवाह) के क्षेत्रों की तुलना में, जैसे धमनी का सीधा खंड। इसलिए, endothelial आकारिकी और अणु अभिव्यक्ति पैटर्न के प्रत्यक्ष अवलोकन अलग प्रवाह प्रतिमानों के तहत endothelial कोशिकाओं के संरचनात्मक और कार्यात्मक phenotypes में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करना चाहिए.
संस्कृतिendothelial कोशिकाओं वास्तविक phenotype व्यक्त नहीं के रूप में वे आंशिक रूप से तरल पदार्थ कतरनी तनाव के प्रभाव के नुकसान के कारण विवो में कर सकते हैं, cytokines आसपास, और सेल सेल या सेल-extracellular मैट्रिक्स बातचीत. इस सहायता करने के लिए, बरकरार endothelial सेल मोनोलेयर शास्त्रीय इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग कर अनुप्रस्थ वर्गों पर अध्ययन किया जा सकता है। हालांकि, endothelial monolayer इतना पतली और नाजुक है कि यह आमतौर पर स्पष्ट रूप से नहीं देखा जा सकता है. En face immunohistochemistry endothelium की आंतरिक सतह का निरीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, लेकिन या तो जटिल या इसके परिणामों में अनिश्चित है क्योंकि endothelium आसानी से अंतर्निहित ऊतक से छीन लिया है, या चूहों या खरगोशों की धमनी दीवार का सिर्फ हिस्सा, जिसकी दीवारें मोटी हैं,4,5घुड़सवार हैं .
माउस मॉडल कई मामलों में अन्य जानवरों की अधिक से अधिक काफी लाभ है. यहाँ, हम C57BL/6 माउस में महाधमनी मेहराब और थोरैसिक महाधमनी की एंडोथेलियल कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए एक संशोधित एन फेस इम्यूनोफ्लोरेसेंस तकनीक का उपयोग करते हैं। इस प्रकार की तकनीक का व्यापक रूप से विभिन्न प्रवाह पैटर्नों में एंडोथेलियल रोग विज्ञान का अध्ययन करने और एथेरोस्क्लेरोसिस6,7,8,9,10के विकास में व्यापक रूप से प्रयोग किया गया है . इस विधि वैज्ञानिकों endothelium की पूरी सतह स्पष्ट रूप से निरीक्षण करने के लिए और विभिन्न तरल पदार्थ कतरनी तनाव के तहत क्षेत्रों में एक दिया प्रोटीन की अभिव्यक्ति पैटर्न की तुलना करने के लिए अनुमति देता है।
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Protocol
सभी पशु प्रयोगों शंघाई Jiao टोंग विश्वविद्यालय के पशु संसाधन पर समिति द्वारा अनुमोदित प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के अनुसार आयोजित किया गया.
1. माउस ओर्टा का भ्रम
- संक्षेप में, 12 सप्ताह पुराने C57BL/6 चूहों सोडियम पेंटोबार्बिटल (50 मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर के वजन) के इंट्रापेरिटोनल इंजेक्शन के साथ एनेस्थेटाइज़ करें। धीरे पूंछ pinching द्वारा उचित एनेस्थेटाइजेशन की पुष्टि करें।
नोट: यदि कोई आंदोलन नहीं देखा जाता है, तो प्रयोग शुरू करने के लिए पशु को पर्याप्त रूप से एनेस्थेटीकृत किया जाता है। - चिपकने वाला टेप के साथ कागज तौलिए के एक ढेर करने के लिए माउस के पंजे टेप।
- संदंश के साथ माउस की त्वचा को पकड़ो और छाती के शीर्ष करने के लिए पेट से कैंची की एक जोड़ी के साथ त्वचा में कटौती।
- कैंची की एक तेज जोड़ी के साथ रिबकेज के नीचे पेट की गुहा खोलें।
- स्टर्नम को संदंश के साथ उठाएं और डायाफ्राम को काटें; फिर, वक्ष गुहा को बेनकाब करने के लिए रिबकेज को काट ें।
- कैंची के साथ जिगर के ठीक ऊपर वेना cava काट.
- दबाव perfuse (100 mmHg) के लिए धमनी का पेड़ 5 मिनट के लिए prechilled सामान्य नमकीन युक्त 40 इकाइयों / फिर, फॉस्फेट-बफर ्ड नमकीन (पीबीएस, पीएच 7.4) में 3 मिनट के लिए प्रीचिल्ड 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड के साथ परफ्यूस।
- सभी मांसपेशियों, अंगों, और वसा निकालें जब तक कि aorta उजागर किया जाता है.
- माउस को विच्छेदन सूक्ष्मदर्शी के नीचे रखें।
2. विच्छेदन और aorta के longitudinally खोलने
- एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत स्पष्ट रूप से माओरटा को उजागर करें और जितना संभव हो उतना साफ के रूप में वावरता के साथ संयोजी ऊतकों को हटा दें, नाजुक संदंश और नाजुक कैंची की एक जोड़ी के साथ (चित्र 1)।
- दिल से सीलिएक ट्रंक को नाजुक कैंची की एक जोड़ी के साथ वक्ष कण को अलग करें और पीबीएस के साथ 6 सेमी सेल कल्चर डिश में ऑर्टा डाल दें। कट खोलो aorta longitudinally, कम वक्र के साथ, और अधिक से अधिक वक्र के साथ जब तक सीधे खंड से मुलाकात की है. सूक्ष्मचक्रियों के साथ, जैसे कि चित्र 2में दर्शाए गए हैं, महाधमनी मेहराब की तीन शाखाओं को काट दें, जिनमें अनिकेत, सामान्य ग्रीवा और बाईं सबक्लेवियन धमनी शामिल हैं।
3. पूर्व उपचार और aorta के इम्यूनोस्टेनिंग
- 10 मिनट के लिए पीबीएस में 0.1% polyoxyethylene ऑक्टिल फेनिल ईथर के साथ aorta permebilize और यह Tris-बफर्ड नमकीन (टीबीएस) में 10% सामान्य बकरी सीरम के साथ ब्लॉक 2.5% polysorbate 20 के लिए 1 एच कमरे के तापमान पर एक 12 अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट में.
- इसके बाद, 5 g/mL खरगोश विरोधी VCAM-1 और 5 g/mL चूहा विरोधी VE-cadherin के साथ अवरुद्ध बफर में, रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर के साथ aorta इनक्यूबेट करें।
- वाशिंग समाधान के साथ नमूना 3x rinsing के बाद (टीबीएस युक्त 2.5% polysorbate 20), कमरे में 1 एच के लिए फ्लोरोसेंट-कंजेटेड माध्यमिक एंटीबॉडी (1:1,000 कमजोर पड़ने, एलेक्सा फ्लोर 555 लेबल विरोधी रैबिट आईजीजी और एलेक्सा फ्लोर 488 लेबल विरोधी रैट आईजीजी) लागू तापमान. धोने के समाधान में 3x कुल्ला.
- 4', 6-diamidino-2-फेनिलिनोल (DAPI) (1 g/mL) के साथ 10 मिनट के लिए और धोने के समाधान में 3x कुल्ला के साथ aorta काउंटर।
4. कांच की स्लाइड पर aorta के माउंटिंग
- नीचे luminal सतह के साथ एक coverslip पर aorta प्लेस और यह antifade बढ़ते समाधान करने के लिए धीरे धीरे ले जाएँ पहले coverslip पर गिरा दिया. नमूना फ्लैट रखने के लिए ओर्टा को धीरे से फैलाएं।
- कवरस्लिप का उलटा करें और स्लाइड ग्लास पर रखें। किसी भी हवा के बुलबुले नमूना और कांच के बीच रहने के लिए अनुमति देने के लिए नहीं लिया जाना चाहिए ध्यान दिया जाना चाहिए।
5. aorta का अवलोकन
- एक लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोप के साथ aorta की जांच.
- छवि-प्रो प्लस सॉफ्टवेयर के साथ एन चेहरा छवियों में वांछित क्षेत्र से विभिन्न चैनलों के रंग तीव्रता का विश्लेषण करें।
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Representative Results
एक 12 सप्ताह पुराने C57BL/6 माउस euthanized और सामान्य नमकीन युक्त 40 इकाइयों / माउस ओर्टा को एक विच्छेदन सूक्ष्मदर्शी के अंतर्गत उजागर किया गया था (चित्र 1), विच्छेदित, और खुले लंबे समय तक काट दिया गया (चित्र 2)। संवहनी अंत:प्रवाहिनी कोशिकाओं के अवमुख इम्यूनोफ्लोरेस स्थापत्य को चित्र 3 तथा सारणी 1में दर्शाए अनुसार किया गया था. VE-cadherin के साथ संवहनी सेल आसंजन प्रोटीन-1 (VCAM-1) अभिव्यक्ति के सामना इम्यूनोफ्लोरेसींस माउस आवरा के विभिन्न क्षेत्रों से अलग-अलग प्रवाह पैटर्न के तहत दिखाया गया था। बेहतर दृश्य के लिए सेल नाभिक को दिखाने के लिए डीएपीआई को भी जवाबी कार्रवाई की गई थी। endothelial और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं को आसानी से सेल नाभिक की आकृति विज्ञान से प्रतिष्ठित किया जा सकता है जब माइक्रोस्कोप के तहत z-stacks के माध्यम से देख के बाद से endothelial सेल नाभिक अंडाकार आकार और धुरी के आकार का चिकनी से बड़ा कर रहे हैं पेशी कोशिका नाभिक. प्रतिनिधि एन फेस छवियों को चित्र 4में दिखाया गया है। आरटा की जांच एलएसएम 710 लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप (सामग्री की तालिका) द्वारा एक फ्लुअर 40x/1,3 तेल लेंस के साथ की गई थी। एन फेस इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला से, हम स्पष्ट रूप से और सीधे निरीक्षण कर सकते हैं कि VCAM-1 की अभिव्यक्ति अशांत प्रवाह के तहत क्षेत्रों में अधिक प्रचुर मात्रा में था (ओर्टा मेहराब की कम वक्रता) स्थिर प्रवाह के तहत उन लोगों की तुलना में (ओर्टा मेहराब की अधिक वक्रता) और वक्षीय आवराकार।
चित्र 1 : एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत माउस aorta उजागर. जितना संभव हो उतना साफ रूप में वावरता के साथ संयोजी ऊतकों को निकालें। एक ] innominate धमनी; ख ] छोड़ दिया आम ग्रीवा धमनी; c ] बायां सबक्लेवियन धमनी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2 : माउस वक्ष आवड़ा का विच्छेदन और इसे लंबे समय तक खुला काटना. (ए) हृदय से सीलिएक ट्रंक तक वक्ष आरोटा को लंबे समय तक कम वक्र के साथ और अधिक से अधिक वक्र के साथ, जब तक सीधा खंड पूरा नहीं किया जाता था, तब तक। महाधमनी मेहराब की तीन शाखाओं, जिनमें अनिकेत, छोड़ दिया आम ग्रीवा, और बाएं सबक्लेवियन धमनी भी माइक्रोसिकर्स के साथ खुले थे। लाल डैश्ड रेखाएं काटने की रेखा का संकेत देती हैं। (बी) ऑर्टा खोला गया था और कांच की स्लाइड पर फ्लैट फैला हुआ था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3 : एन चेहरे इम्यूनोफ्लोरेसेंस संवहनी endothelial कोशिकाओं के धुंधला के लिए स्कीमा. सबसे पहले, पीबीएस में 0.1% polyoxyethylene ऑक्टिल फेनिल ईथर के साथ 10 मिनट के लिए विभाजित ओरोटा permeabilize और टीबीएस में 10% सामान्य बकरी सीरम के साथ ब्लॉक 2.5% polysorbate 20 के लिए 1 एच कमरे के तापमान पर एक 1 2 अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट में. इसके बाद, रात भर अवरुद्ध बफर में प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ ऑर्टा को 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, और इसे धोने के समाधान के साथ तीन बार कुल्ला करें (टीबीएस जिसमें 2.5% पॉलीसोर्बेट 20) है। फिर, कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए फ्लोरोसेंट-कंजुटेड माध्यमिक एंटीबॉडी लागू करें और तीन बार कुल्ला। 10 मिनट के लिए DAPI के साथ aorta काउंटर और यह धोने के समाधान में तीन बार कुल्ला. अंत में, एक गिलास स्लाइड पर aorta माउंट और एक लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोप द्वारा aorta निरीक्षण. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 4 : प्रतिनिधि चेहरा धुंधला परिणाम. (ए) माउस आरोटा (डी-प्रवाह क्षेत्र) की कम वक्रता के इम्यूनोफ्लोरेसी विश्लेषण और विभिन्न प्रवाह प्रतिमानों के तहत एंडोथेलियल वीसीएएम-1 अभिव्यक्ति की तुलना करने के लिए अधिक वक्रता या थोरैसिक आरोटा (एस-प्रवाह क्षेत्र) का सामना करना। एंडोथेलियल सेल आकारिकी VE-cadherin धुंधला द्वारा दिखाया गया है. (ख) प्रतिनिधि डी-प्रवाह क्षेत्र (कम वक्रता) और एस-प्रवाह क्षेत्र (अधिक वक्रता और थोरैसिक वारोटा) तीरों द्वारा इंगित किए जाते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| चरण | प्रक्रिया | बफ़र | तापमान | समय |
| 1 | पर्मिबिलाइज़ करें | पीबीएस में 0.1% पॉलीऑक्सीएथिलीन ऑक्टिल फ़ेनिल ईथर | कमरे का तापमान | 10 मिनट |
| 2 | अवरुद्ध | Tris-बफर नमकीन (टीबीएस) में 10% सामान्य बकरी सीरम जिसमें 2.5% polysorbate 20 | कमरे का तापमान | 1 ज |
| 3 | पहला एंटीबॉडी (5 ग्राम/ | बफ़र ब्लॉक करना | 4 डिग्री सेल्सियस | रात भर |
| 4 | कुल्ला | टीबीएस जिसमें 2.5% पॉलीसर्बेट 20 | कमरे का तापमान | 5 मिनट, 3 बार |
| 5 | फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी (1:1000) | बफ़र ब्लॉक करना | कमरे का तापमान | 1 ज |
| 6 | कुल्ला | टीबीएस जिसमें 2.5% पॉलीसर्बेट 20 | कमरे का तापमान | 5 मिनट, 3 बार |
तालिका 1: en face के बारे में विस्तृत जानकारी इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला प्रक्रिया।
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Discussion
एंडोथेलियम लिपिड, सूजन मध्यस्थों, और तरल कतरनी तनाव1,11,12सहित कई proatherogenic कारकों के संपर्क में है. सीटू में एंडोथेलियल कोशिकाओं का प्रत्यक्ष अवलोकन चोट उत्तेजनाओं के प्रत्युत्तर में कोशिका आकारिकी, अंतरकोशिकीय संधि, और अणु अभिव्यक्ति पैटर्न में परिवर्तनों का विश्लेषण करने के लिए विशेष लाभ प्रदान करता है।
पिछले अध्ययनों से दो अलग - अलग एन् फेस इम्यूनोहिस्टोकेमिकल तकनीकें उपलब्ध कराई गई हैं , जो धमनी की दीवार4,5के एंडोथेलियम का निरीक्षण करती हैं . एक एक विशेष तकनीक द्वारा पोत की दीवार से endothelium अलग करके एक endothelial मोनोलेयर प्राप्त करने के लिए है, जो मास्टर करने के लिए मुश्किल है और धमनी4की शाखाओं स्थलों पर बहुत endothelium के नुकसान में परिणाम हो सकता है. दूसरे के रूप में हम वर्णित पूरी धमनी दीवार बढ़ रहा है. पूरे-माउंट तैयारी प्रदर्शन करने के लिए आसान है और खरगोश और चूहों5,13में पूरे endothelial मोनोलेयर बनाए रख सकते हैं। हालांकि, पूरे माउस महाधमनी नमूना फ्लैट का प्रसार आसान नहीं है, और ऐसा करने में विफलता काफी हद तक अवलोकन की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकती है। यहाँ वर्णित महाधमनी नमूने की तैयारी, वक्रता के साथ खुला काट दिया और luminal सतह कवरस्लिप पर नीचे का सामना करना पड़ा, यह आसान स्लाइड ग्लास पर महाधमनी नमूना फ्लैट प्रसार करने के लिए बनाता है. इसके अलावा, एक लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोप बेहतर रक्त वाहिका अस्तर पतली endothelial सेल मोनोलेयर पर ध्यान केंद्रित करने के लिए आवश्यक है।
इस तकनीक का एक महत्वपूर्ण बिंदु महाधमनी नमूना के रूप में संभव के रूप में फ्लैट खिंचाव के लिए महाधमनी का एक बेहतर अवलोकन प्राप्त करने के लिए है. इसके अलावा, हेपेरिन को भ्रम से पहले सामान्य लवण में जोड़ा जाना चाहिए, और महाधमनी नमूना प्रक्रिया के दौरान धीरे से इलाज किया जाना चाहिए। पैराफॉर्मेल्डिहाइड को ताजा तैयार किया जाना चाहिए और उपयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाना चाहिए।
इस तकनीक की सीमाएं हैं। सबसे पहले, इस तरह के जमा कम घनत्व लिपोप्रोटीन के रूप में subendothelial पदार्थ का पता लगाने के लिए एन फेस इम्यूनोफ्लोरेसी की क्षमता, ऊतक वर्गों के नियमित इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री की तुलना में सीमित है। दूसरा, फ्लोरोसेंट संकेतों को confocal माइक्रोस्कोप द्वारा स्कैन के बाद आसानी से ब्लीच किया जाता है, विशेष रूप से जबz-अक्ष विश्लेषण करते हैं। इसके अलावा, लक्ष्य अणु की अभिव्यक्ति केवल अपने फ्लोरोसेंट तीव्रता के अनुसार, अर्द्ध परिमाणित किया जा सकता है.
सारांश में, इस संशोधित एन चेहरे इम्यूनोफ्लोरेसी धुंधला तकनीक विभिन्न रक्त प्रवाह प्रतिमानों के तहत क्षेत्रों में संवहनी endothelial कोशिकाओं की आकृति विज्ञान और प्रोटीन अभिव्यक्ति पैटर्न का विश्लेषण करने के लिए एक आसान तरीका प्रदान करता है6,7 और एथेरोस्क्लेरोसिस के रोगजनन में।
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Disclosures
लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
इस अध्ययन चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (ग्रेंट नंबर 81670451, 81770430), शंघाई राइजिंग स्टार कार्यक्रम (ग्रेंट नंबर 17QA1403000) और शंघाई नगर सरकार की विज्ञान प्रौद्योगिकी समिति (ग्रेंट नं. 14441903002, 15411963700).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antifade mountant | Servicebio | G1401 | |
| Delicate Forceps | RWD Life Science | F11001-11 | |
| Delicate Scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| Dissecting Forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| Mciro Spring Scissors | RWD Life Science | S11001-08 | |
| Polyoxyethylene octyl phenyl ether (Triton X-100) | Amresco | M143 | |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Amresco | 0777 | |
| VCAM-1 antibody | Abcam | ab134047 | |
| VE-Cadherin antibody | BD Biosciences | 555289 | |
| Alexa Fluor 555 labeled anti-rabbit IgG | invitrogen | A-31572 | |
| Alexa Fluor 488 labeled anti-rat IgG | invitrogen | A-21208 | |
| Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss |
References
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