Uso dell'immunofluorescenza en faccia per osservare direttamente le cellule endoteliali vascolari
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per l’immunofluorescenza colorazione per osservare direttamente le cellule endoteliali dell’aorta del topo. Questa tecnica è utile quando si studia il fenotipo cellulare e molecolare delle cellule endoteliali in diversi modelli di flusso e nello sviluppo dell’aterosclerosi.
Abstract
I cambiamenti aberranti nel fenotipo endoteliale e nella morfologia sono considerati eventi iniziali nella patogenesi dell’aterosclerosi. L’osservazione diretta dell’endotelio intatto fornirà preziose informazioni per comprendere gli eventi cellulari e molecolari nelle cellule endoteliali disfunzionali. Qui, descriviamo una tecnica di colorazione dell’immunofluorescenza modificata che consente agli scienziati di ottenere immagini chiare della superficie endoteliale intatta e analizzare i modelli di espressione molecolare in situ. Il metodo è semplice e affidabile per osservare l’intero mostrato endoteliale in diversi siti dell’aorta. Questa tecnica può essere uno strumento promettente per comprendere la fisiopatologia dell’aterosclerosi, soprattutto in una fase precoce.
Introduction
I primi cambiamenti nella vascolatura iniziano principalmente nell’endotelio, che funziona come una barriera selettiva tra il sangue e la parete del vaso con i suoi complessi giunzionali stretti intercellulari1. Prove sostanziali indicano un ruolo critico per gli effetti meccanici del flusso sanguigno nella modulazione della funzione endoteliale2. Lo stress da taglio fluido, una forza d’attrito generata dal flusso sanguigno, modella in modo differenziale la morfologia e la funzione delle cellule endoteliali, a seconda dei paradigmi di flusso specifici nei diversi siti vascolari2,3. Le lesioni aterosclerotiche si verificano preferibilmente in siti di flusso sanguigno disturbato (d-flow), come le curve dei vasi, i divisori di flusso e i punti di diramazione, rispetto alle regioni di flusso costante (flusso di s), come il segmento retto dell’arteria. Pertanto, l’osservazione diretta dei modelli di morfologia endoteliale e di espressione molecolare dovrebbe fornire importanti informazioni sui fenotipi strutturali e funzionali delle cellule endoteliali sotto diversi paradigmi di flusso.
Le cellule endoteliali coltivate non possono esprimere il fenotipo effettivo come fanno in vivo in parte a causa della perdita di impatto dello stress di taglio fluido, delle citochine circostanti e delle interazioni tra cellule o cellule extracellulari. Per aiutare questo, il monostrato di cellule endoteliali intatte può essere studiato su sezioni trasversali utilizzando l’immunohistochimica classica. Tuttavia, il monostrato endoteliale è così sottile e fragile che di solito non può essere osservato chiaramente. En viso immunohistochimica è stato utilizzato per osservare la superficie interna dell’endotelio, ma è sia complicato o irregolare nei suoi risultati perché l’endotelio è facilmente spogliato dal tessuto sottostante, o solo una parte della parete arteriosa di ratti o conigli, le cui pareti sono spesse, è montato4,5.
I modelli murini hanno notevoli vantaggi rispetto agli altri animali sotto molti aspetti. Qui, impieghiamo una tecnica di immunofluorescenza en face modificata per analizzare le cellule endoteliali dell’arco aortico e dell’aorta toracica nel topo C57BL/6. Tale tecnica è stata ampiamente utilizzata per studiare la fisiofisiologia endoteliale in diversi modelli di flusso e nello sviluppo dell’aterosclerosi6,7,8,9,10. Questo metodo consente agli scienziati di osservare chiaramente l’intera superficie dell’endotelio e di confrontare i modelli di espressione di una determinata proteina in regioni sotto stress da taglio fluido diverso.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’endotelio è esposto a numerosi fattori proatherogenici, tra cui lipidi, mediatori infiammatori e stress da taglio fluido1,11,12. L’osservazione diretta delle cellule endoteliali in situ fornisce i vantaggi speciali per analizzare i cambiamenti nella morfologia cellulare, nelle giunzioni intercellulari e nei modelli di espressione molecolare in risposta agli stimoli da lesione.
Studi precedenti hann…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (Grant no. 14441903002, 15411963700).
Materials
| Antifade mountant | Servicebio | G1401 | |
| Delicate Forceps | RWD Life Science | F11001-11 | |
| Delicate Scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| Dissecting Forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| Mciro Spring Scissors | RWD Life Science | S11001-08 | |
| Polyoxyethylene octyl phenyl ether (Triton X-100) | Amresco | M143 | |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Amresco | 0777 | |
| VCAM-1 antibody | Abcam | ab134047 | |
| VE-Cadherin antibody | BD Biosciences | 555289 | |
| Alexa Fluor 555 labeled anti-rabbit IgG | invitrogen | A-31572 | |
| Alexa Fluor 488 labeled anti-rat IgG | invitrogen | A-21208 | |
| Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss |
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