Identificering af amino syre-over producenter ved hjælp af sjældne-codon-rige markører
Summary
Denne undersøgelse præsenterer en alternativ strategi for konventionel toksisk analog-baseret metode til at identificere aminosyre over producenter ved hjælp af sjældne-codon-rige markører for at opnå nøjagtighed, følsomhed, og høj gennemløb samtidigt.
Abstract
For at tilfredsstille det stadigt voksende marked for aminosyrer er der behov for højtydende produktions stammer. Aminosyren over producenter er konventionelt identificeret ved at udnytte de konkurrencer mellem aminosyrer og deres analoner. Men, denne analoge-baserede metode er af lav nøjagtighed, og korrekt analoner til specifikke aminosyrer er begrænset. Her præsenterer vi en alternativ strategi, der muliggør en nøjagtig, følsom og høj gennemløbs screening af aminosyre over producenter ved hjælp af sjældne-codon-rige markører. Denne strategi er inspireret af fænomenet codon skik bias i protein oversættelse, for hvilke kodon er kategoriseret i fælles eller sjældne dem baseret på deres frekvenser af forekomsten i kodning DNA. Oversættelsen af sjældne kodon afhænger af deres tilsvarende sjældne Transfer RNAs (trnas), som ikke kan oplades fuldt ud af de cognate aminosyrer under hungersnød. Teoretisk kan de sjældne tRNAs oplades, hvis der er et overskud af aminosyrer efter opladning af de synonyme fælles isoacceptorer. Derfor kan retarderede oversættelser forårsaget af sjældne kodon gendannes ved fodring eller intracellulære over produktioner af de tilsvarende aminosyrer. Under denne antagelse etableres et udvælgelses-eller screeningssystem til identificering af aminosyre overproducenter ved at erstatte de almindelige kodon af de målrettede aminosyrer med deres synonyme sjældne alternativer i antibiotikaresistensgener eller gener kodning af fluorescerende eller kromogene proteiner. Vi viser, at protein udtryk kan være stærkt hæmmet af inkorporering af sjældne kodon, og at niveauerne af proteiner korrelerer positivt med aminosyre koncentrationer. Ved hjælp af dette system, over producenter af flere aminosyrer kan let screenes ud fra mutation biblioteker. Denne sjældne-codon-baserede strategi kræver kun et enkelt modificeret gen, og værten er mindre tilbøjelige til at undslippe udvælgelsen end i andre metoder. Det tilbyder en alternativ tilgang til at opnå aminosyre over producenter.
Introduction
Den nuværende produktion af aminosyrer er stærkt afhængig af gæring. Men, titre og udbytter for de fleste aminosyre produktion stammer er under de stigende krav fra det globale aminosyre marked, der er værd milliarder af dollars1,2. Opnåelse af højtydende aminosyre over producenter er afgørende for opgraderingen af aminosyre industrien.
Traditionel strategi til at identificere aminosyre over producenter udnytter konkurrencer mellem aminosyrer og deres analogier i proteinsyntesen3,4. Disse analogerne er i stand til at oplade tRNAs, der genkender de tilsvarende aminosyrer og dermed hæmme forlængelsen af peptidkæder, fører til anholdt vækst eller celledød5. En måde at modstå de analoge belastninger er at øge koncentrationerne af intracellulære aminosyrer. De berigede aminosyrer vil udkonkurrere analoger til finite tRNAs og sikre den korrekte syntese af funktionelle proteiner. Derfor kan stammer, der overlever analoerne vælges og er sandsynligvis over producenter af de tilsvarende aminosyrer.
Selv om det viste sig at være vellykket at udvælge over producenter for aminosyrer som L-leucin6, lider den analoge-baserede strategi af alvorlige ulemper. Et stort problem er den analoge modstand stammer fra processen med mutagenese eller gennem spontane mutationer. Stammer med resistens kan undslippe udvælgelsen ved at blokere, eksportere eller nedværdigende analoner5. En anden bekymring er de giftige bivirkninger af analoerne på andre cellulære processer7. Som en konsekvens, stammer, der overlever den analoge udvælgelse kan ikke være aminosyren over producenter, mens de ønskede over producenter kunne være falsk udryddet på grund af de negative bivirkninger.
Her præsenteres en ny strategi baseret på loven om codon bias for at opnå nøjagtige og hurtige identifikationer af aminosyre over producenter. De fleste aminosyrer er kodet af mere end en nucleotid triplet, der er begunstiget forskelligt af værts organismerne 8,9. Nogle kodon bruges sjældent i kodning sekvenser og omtales som de sjældne kodon. Deres oversættelser til aminosyrer er afhængige af de cognate tRNAs, der bærer de tilsvarende aminosyrer. Men de trnas, der genkender sjældne kodon normalt har meget lavere mængder end trnas af de fælles kodon10,11. Derfor er disse sjældne tRNAs mindre tilbøjelige til at fange de frie aminosyrer i konkurrencerne med andre isoacceptorer, og oversættelser af de sjældne-codon-rige sekvenser begynder at aftage eller endda afsluttes, når mængderne af aminosyrer er begrænset 10. oversættelserne kunne teoretisk set genoprettes, hvis der er en aminosyre overskud efter opladning af de synonyme fælles tRNAs på grund af over produktioner eller ekstra fodring af de tilsvarende aminosyrer12. Hvis det sjældne-codon-rige gen koder et valg eller screening markør, kan stammer, der udviser de tilsvarende fænotyper, så let identificeres og er sandsynligvis over producenterne af de målrettede aminosyrer.
Ovennævnte strategi anvendes til at etablere en udvælgelse og et screening system til identifikation af aminosyre over producenter. Udvælgelsessystemet bruger antibiotikaresistensgener (f. eks. kanR) som markører, mens Screenings systemet bruger de gener, som koder fluorescerende (f. eks. grønt fluorescerende protein [gfp]) eller kromogene (f. eks. prancerpurple) proteiner. Markør generne i begge systemer ændres ved at erstatte definerede numre af de fælles kodon for den målrettede aminosyre med dens synonyme sjældne alternativ. Stammer i mutation biblioteket, der havnen den sjældne-codon-rige markør genet udvælges eller screenes under ordentlige forhold, og over producenter af de målrettede aminosyrer kan let identificeres. Arbejdsprocessen begynder med opførelsen af den sjældne-codon-rige markør gensystem, efterfulgt af optimering af arbejdsvilkårene, og derefter identifikation og verifikation af aminosyren over producenter. Denne analoge-uafhængige strategi er baseret på dogmet i protein oversættelse og er praktisk talt blevet verificeret for at muliggøre præcise og hurtige identifikationer af aminosyre over producenter. Teoretisk, det kunne være direkte ansat til aminosyrer med sjældne kodon og til alle mikroorganismer. I alt vil den sjældne-codon-baserede strategi tjene som et effektivt alternativ til den konventionelle analog-baserede tilgang, når passende analogier til specifikke aminosyrer er utilgængelige, eller når en høj falsk positiv sats er den største bekymring. Nedenstående protokol bruger leucin rare codon til at demonstrere denne strategi for at identificere over producenter af Escherichia coli L-leucin.
Protocol
Representative Results
Discussion
Antallet af sjældne kodon i markørgener og udvælgelse eller screening medium er afgørende for at hæmme protein udtryk fra de sjældne-codon-modificerede markørgener. Hvis der ikke kan påvises nogen signifikant forskel mellem protein udtryk fra Wild-type markørgener og derivater heraf, kan en forøgelse af antallet af sjældne kodon eller anvendelse af et nærings begrænset medium forstærke forskellene. Men hvis hæmnings effekten er for stærk, kan protein udtrykkene ikke inddrives, selv ved ekstra fodring af d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbejdet blev understøttet af National Natural Science Foundation i Kina (Grant No. 21676026), det nationale Key R & D program i Kina (Grant No. 2017YFD0201400), og China postdoc Science Foundation (Grant No. 2017M620643). Værker på UCLA Institute of avancement (Suzhou) blev støttet af de interne tilskud fra Jiangsu-provinsen og Suzhou Industrial Park.
Materials
| Acetonitrile | Thermo | 51101 | |
| EasyPure HiPure Plasmid MiniPrep Kit | Transgen | EM111-01 | |
| EasyPure Quick Gel Extraction Kit | Transgen | EG101-01 | |
| Gibson assembly master mix | NEB | E2611S | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Solarbio | I8070 | |
| L-leucine | Sigma | L8000 | |
| Microplate reader | Biotek | Synergy 2 | |
| n-hexane | Thermo | H3061 | |
| Phenyl isothiocyanate | Sigma | P1034 | |
| PrancerPurple CPB-37-441 | ATUM | CPB-37-441 | |
| TransStar FastPfu Fly DNA polymerase | Transgen | AP231-01 | |
| Triethylamine | Sigma | T0886 | |
| Ultra-high performance liquid chromatography | Agilent | 1290 Infinity II | |
| Wild type C. glutamicum | ATCC | 13032 | |
| XL10-Gold E. coli competent cell | Agilent | 200314 | |
| ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 column | Agilent | 959759-902K |
References
- Tatsumi, N., Inui, M. . Corynebacterium glutamicum: biology and biotechnology. , (2012).
- Tonouchi, N., Ito, H., Yokota, A., Ikeda, M. Present global situation of amino acids in industry. Amino Acid Fermentation. , 3-14 (2017).
- Gusyatiner, M., Lunts, M., Kozlov, Y., Ivanovskaya, L., Voroshilova, E. . DNA coding for mutant isopropylmalate synthase, L-leucine-producing microorganism and method for producing L-leucine. , (2005).
- Park, J. H., Lee, S. Y. Towards systems metabolic engineering of microorganisms for amino acid production. Current Opinion in Biotechnology. 19 (5), 454-460 (2008).
- Norris, R., Lea, P. The use of amino acid analogues in biological studies. Science Progress. , 65-85 (1976).
- Park, J. H., Lee, S. Y. Fermentative production of branched chain amino acids: a focus on metabolic engineering. Applied Microbiology and Biotechnology. 85 (3), 491-506 (2010).
- Bach, T. M., Takagi, H. Properties, metabolisms, and applications of L-proline analogues. Applied Microbiology and Biotechnology. 97 (15), 6623-6634 (2013).
- Crick, F. H. C. On the genetic code. Science. 139 (3554), 461-464 (1963).
- Plotkin, J. B., Kudla, G. Synonymous but not the same: the causes and consequences of codon bias. Nature Reviews Genetics. 12 (1), 32-42 (2011).
- Dittmar, K. A., Sørensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino‐acid starvation. EMBO Reports. 6 (2), 151-157 (2005).
- Elf, J., Nilsson, D., Tenson, T., Ehrenberg, M. Selective charging of tRNA isoacceptors explains patterns of codon usage. Science. 300 (5626), 1718-1722 (2003).
- Sørensen, M. A. Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel+ and Rel− strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy. Journal of Molecular Biology. 307 (3), 785-798 (2001).
- Zheng, B., et al. Utilization of rare codon-rich markers for screening amino acid overproducers. Nature Communications. 9 (1), 3616 (2018).
- Richardson, S. M., Wheelan, S. J., Yarrington, R. M., Boeke, J. D. GeneDesign: rapid, automated design of multikilobase synthetic genes. Genome Research. 16 (4), 550-556 (2006).
- Xiong, A. -. S., et al. PCR-based accurate synthesis of long DNA sequences. Nature Protocols. 1 (2), 791-797 (2006).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).
- Cohen, S. A., Bidlingmeyer, B. A., Tarvin, T. L. PITC derivatives in amino acid analysis. Nature. 320 (6064), 769-770 (1986).
- Zhou, J., Liu, W. J., Peng, S. W., Sun, X. Y., Frazer, I. Papillomavirus capsid protein expression level depends on the match between codon usage and tRNA availability. Journal of Virology. 73 (6), 4972-4982 (1999).
- Gregg, C. J., et al. Rational optimization of tolC as a powerful dual selectable marker for genome engineering. Nucleic Acids Research. 42 (7), 4779-4790 (2014).
- Pelicic, V., Reyrat, J. M., Gicquel, B. Expression of the Bacillus subtilis sacB gene confers sucrose sensitivity on mycobacteria. Journal of Bacteriology. 178 (4), 1197-1199 (1996).
- Avcilar-Kucukgoze, I., et al. Discharging tRNAs: a tug of war between translation and detoxification in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 44 (17), 8324-8334 (2016).
- Mundhada, H., Schneider, K., Christensen, H. B., Nielsen, A. T. Engineering of high yield production of L-serine in Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering. 113 (4), 807-816 (2016).
- Makosky, P. C., Dahlberg, A. E. Spectinomycin resistance at site 1192 in 16S ribosomal RNA of E. coli: an analysis of three mutants. Biochimie. 69 (8), 885-889 (1987).
- Feng, L., Tumbula-Hansen, D., Toogood, H., Söll, D. Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single amino acid change. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5676-5681 (2003).
- Naganuma, M., et al. The selective tRNA aminoacylation mechanism based on a single G• U pair. Nature. 510 (7506), 507 (2014).
- Hoesl, M. G., et al. Chemical evolution of a bacterial proteome. Angewandte Chemie International Edition. 54 (34), 10030-10034 (2015).
- Hershberg, R., Petrov, D. A. Selection on codon bias. Annual Review of Genetics. 42, 287-299 (2008).
- Huo, Y. -. X., et al. Conversion of proteins into biofuels by engineering nitrogen flux. Nature Biotechnology. 29, 346 (2011).
