希少コドンリッチマーカーを用いてアミノ酸過剰生産者を同定
Summary
本研究では、希少コドンリッチマーカーを用いてアミノ酸過剰生産者を同定する従来の有毒アナログベースの方法に代わる戦略を提示し、精度、感度、高スループットを同時に達成する。
Abstract
増え続けるアミノ酸市場を満たすためには、高性能な生産株が必要です。アミノ酸過剰生産者は、従来、アミノ酸とその類似体との競争を利用して同定される。しかし、このアナログベースの方法は精度が低く、特定のアミノ酸に対する適切なアナログは限られています。ここでは、希少コドンリッチマーカーを用いたアミノ酸オーバープロデューサーの正確で敏感でハイスループットのスクリーニングを可能にする代替戦略を紹介する。この戦略は、コードDNAにおける発生頻度に基づいてコドンが一般的または希少なものに分類されるタンパク質翻訳におけるコドン使用バイアスの現象に触発されています。希少コドンの翻訳は、飢餓下の歯車アミノ酸では完全に充電できない、対応する希少転写RNA(tRNA)に依存します。理論的には、同義の一般的な同化性等化剤を充電した後にアミノ酸の余剰がある場合、希少なtRNAを充電することができます。したがって、希少なコドンによって引き起こされる遅滞翻訳は、対応するアミノ酸の摂食または細胞内過剰産生によって回復することができる。この仮定の下で、標的アミノ酸の一般的なコドンを抗生物質耐性遺伝子または遺伝子の同義的希少な代替物に置き換えることによって、アミノ酸過剰生産者を同定するための選択またはスクリーニングシステムが確立される。蛍光または発色性タンパク質をコードする。我々は、タンパク質発現が希少なコドンの取り込みによって大きく妨げられ、タンパク質のレベルがアミノ酸濃度と正に相関することを示す。このシステムを使用して、複数のアミノ酸の過剰生産者は、変異ライブラリーから容易にスクリーニングすることができる。この希少コドンベースの戦略は、単一の改変遺伝子のみを必要とし、宿主は他の方法よりも選択を逃れる可能性が低い。これは、アミノ酸オーバープロデューサーを得るための代替アプローチを提供しています.
Introduction
アミノ酸の現在の生産は、発酵に大きく依存しています。しかし、ほとんどのアミノ酸産生株の力価および収量は、数十億ドルの価値がある世界的なアミノ酸市場の需要の高まりを下回っています1,2.アミノ酸産業のアップグレードには、高性能アミノ酸過剰生産者の獲得が重要です。
アミノ酸過剰生産者を同定する従来の戦略は、タンパク質合成におけるアミノ酸とその類似体との競争を利用する3,4.これらの類似体は、対応するアミノ酸を認識するtRNAを充電し、したがってペプチド鎖の伸びを阻害し、逮捕された増殖または細胞死5につながる。アナログストレスに抵抗する 1 つの方法は、細胞内アミノ酸の濃度を増加させます。.濃縮アミノ酸は、有限tRNAのアナログを上回り、機能性タンパク質の正しい合成を保証します。したがって、類似体を生き残る株は選択することができ、対応するアミノ酸の過剰生産者である可能性が高い。
L-ロイシン6などのアミノ酸の過剰生産者の選択に成功したが、アナログベースの戦略は深刻な欠点に苦しんでいる。主な懸念の1つは、変異形成の過程または自発的な突然変異によって生じたアナログ抵抗である。抵抗を持つ株は、アナログ5を遮断、エクスポート、または劣化することによって選択を逃れることができます。もう一つの懸念は、他の細胞プロセス7にアナログの有毒な副作用です。その結果、アナログ選択を生き残る株はアミノ酸過剰生産者ではないかもしれませんが、所望の過剰生産者は負の副作用のために誤って根絶される可能性があります。
ここでは、アミノ酸過剰生産者の正確かつ迅速な同定を達成するために、コドンバイアスの法則に基づく新しい戦略を提示する。ほとんどのアミノ酸は、宿主生物8、9によって異なって好まれる複数のヌクレオチドトリプレットによってコードされる。一部のコドンはコーディングシーケンスではほとんど使用されず、希少なコドンと呼ばれています。アミノ酸への彼らの翻訳は、対応するアミノ酸を運ぶ認知tRNAに依存しています.しかし、希少なコドンを認識するtRNAは、通常、一般的なコドン10、11のtRNAよりもはるかに低い存在量を持っています。その結果、これらの希少なtRNAは、他のアイソセプターとの競争で遊びのアミノ酸を捕捉する可能性が低く、希少コドンリッチ配列の翻訳は、アミノ酸の量が限られているときに減速し始めるか、あるいは終了する10.翻訳は、理論的には、対応するアミノ酸12の過剰産生または余分な供給に起因する同義の一般的なtRNAを充電した後にアミノ酸の余剰がある場合に復元することができる。希少コドンリッチ遺伝子が選択マーカーまたはスクリーニングマーカーをコードする場合、対応するフェノタイプを示す株を容易に同定することができ、標的アミノ酸の過剰生産者である可能性が高い。
上記の戦略は、アミノ酸過剰生産者の同定のための選択およびスクリーニングシステムを確立するために適用される。選択システムは、抗生物質耐性遺伝子(例えば、カンR)をマーカーとして使用し、スクリーニングシステムは蛍光をコードする遺伝子(例えば、緑色蛍光タンパク質[GFP])または発色性(例えば、PrancerPurple)タンパク質を使用する。両方のシステムのマーカー遺伝子は、標的アミノ酸の共通コドンの定義された数をその代名詞希少代替に置き換えることによって修飾される。希少コドンリッチマーカー遺伝子を保有する変異ライブラリー内の株は、適切な条件下で選択またはスクリーニングされ、標的アミノ酸の過剰生産者を容易に同定することができる。ワークフローは、希少コドンリッチマーカー遺伝子システムの構築から始まり、その後、労働条件の最適化、次にアミノ酸オーバープロデューサーの同定と検証が行われます。このアナログ非依存戦略は、タンパク質翻訳の教義に基づいており、アミノ酸オーバープロデューサーの正確かつ迅速な同定を可能にするために実質的に検証されています。理論的には、希少なコドンを含むアミノ酸やすべての微生物に直接使用することができます。全体として、希少コドンベースの戦略は、特定のアミノ酸に対する適切なアナログが利用できない場合、または高い偽陽性率が主な懸念事項である場合に、従来のアナログベースのアプローチに代わる効率的な代替手段として機能します。以下のプロトコルは、ロイシンレアコドンを使用して、エシェリヒア大腸菌L-ロイシンオーバープロデューサーを同定する際にこの戦略を実証します。
Protocol
Representative Results
Discussion
マーカー遺伝子および選択またはスクリーニング媒体中の希少コドンの数は、希少コドン修飾マーカー遺伝子からのタンパク質発現を阻害するために重要である。野生型マーカー遺伝子とその誘導体からのタンパク質発現に有意な差が検出されない場合、希少なコドンの数を増やすか、または栄養制限培地を使用すると、その違いを増幅する可能性があります。しかしながら、阻害効果が強?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国家自然科学財団(助成金第21676026号)、中国国家鍵研究開発プログラム(助成金第2017YFD0201400)、中国ポストドクター科学財団(助成第2017M620643号)が共同で支援した。UCLA進歩研究所(蘇州)の作品は、江蘇省と蘇州工業団地からの内部助成金によって支えられました。
Materials
| Acetonitrile | Thermo | 51101 | |
| EasyPure HiPure Plasmid MiniPrep Kit | Transgen | EM111-01 | |
| EasyPure Quick Gel Extraction Kit | Transgen | EG101-01 | |
| Gibson assembly master mix | NEB | E2611S | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Solarbio | I8070 | |
| L-leucine | Sigma | L8000 | |
| Microplate reader | Biotek | Synergy 2 | |
| n-hexane | Thermo | H3061 | |
| Phenyl isothiocyanate | Sigma | P1034 | |
| PrancerPurple CPB-37-441 | ATUM | CPB-37-441 | |
| TransStar FastPfu Fly DNA polymerase | Transgen | AP231-01 | |
| Triethylamine | Sigma | T0886 | |
| Ultra-high performance liquid chromatography | Agilent | 1290 Infinity II | |
| Wild type C. glutamicum | ATCC | 13032 | |
| XL10-Gold E. coli competent cell | Agilent | 200314 | |
| ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 column | Agilent | 959759-902K |
References
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