Выявление аминокислотных перепроизводителей с использованием редких Кодон-богатых маркеров
Summary
Это исследование представляет собой альтернативную стратегию к обычным токсичным аналоговым методом в выявлении аминокислотных сверхпроизводителей с помощью редких богатых кодон маркерами для достижения точности, чувствительности и высокой пропускной силы одновременно.
Abstract
Для удовлетворения постоянно растущего рынка аминокислот необходимы высокопроизводительные производственные штаммы. Аминокислоты overproducers условно определены путем использования конкуренции между аминокислотами и их аналогов. Однако этот аналоговый метод имеет низкую точность, а надлежащие аналоги для конкретных аминокислот ограничены. Здесь мы представляем альтернативную стратегию, которая позволяет точно, чувствительный и высокопроизводительный скрининг аминокислот с использованием редких кодон богатых маркеров. Эта стратегия вдохновлена феноменом смещения использования кодона в переводе белков, для которого кодоны классифицируются на общие или редкие на основе их частот возникновения в кодирующей ДНК. Перевод редких кодонов зависит от их соответствующих редких переносных РНК (tRNAs), которые не могут быть полностью заряжены аминокислотами cognate под голодом. Теоретически, редкие tRNAs могут быть заряжены, если есть избыток аминокислот после зарядки синонимов общих изоастежителей. Поэтому отсталые переводы, вызванные редкими кодонами, могут быть восстановлены путем кормления или внутриклеточного перепроизводства соответствующих аминокислот. Согласно этому предположению, система отбора или скрининга для выявления аминокислотных производителей устанавливается путем замены общих кодонов целевых аминокислот их синонимами редких альтернатив в генах устойчивости к антибиотикам или генах кодирование флуоресцентных или хромогенных белков. Мы показываем, что протеиновые экспрессии могут быть значительно затруднены включением редких кодонов и что уровни белков положительно коррелируют с аминокислотными концентрациями. Используя эту систему, перепроизводители нескольких аминокислот можно легко отсеивать из библиотек мутаций. Эта стратегия на основе редкого кодона требует только одного модифицированного гена, и усев с меньшей вероятностью избежит выделения, чем в других методах. Он предлагает альтернативный подход для получения аминокислотных производителей.
Introduction
Нынешнее производство аминокислот в значительной степени зависит от брожения. Тем не менее, титры и дает для большинства штаммов производства аминокислот ниже растущих требований глобального рынка аминокислот, который стоит миллиарды долларов1,2. Получение высокопроизводительных аминокислотных производителей имеют решающее значение для модернизации аминокислотной промышленности.
Традиционная стратегия для выявления аминокислот overproducers использует конкуренции между аминокислотами и их аналогов в синтезе белка3,4. Эти аналоги способны заряжать tRNAs, которые распознают соответствующие аминокислоты и тем самым подавляют удлинение пептидных цепей, что приводит к арестованному росту или смерти клеток5. Одним из способов противостоять аналоговым стрессам является увеличение концентрации внутриклеточных аминокислот. Обогащенные аминокислоты превзойдят аналоги конечной тРНК и обеспечат правильный синтез функциональных белков. Таким образом, штаммы, которые выживают аналоги могут быть выбраны и, вероятно, overproducers соответствующих аминокислот.
Хотя оказался успешным в выборе overproducers для аминокислот, таких как L-лейцин6, аналоговая стратегия страдает от серьезных недостатков. Одной из основных проблем является аналоговое сопротивление, возникает из процесса мутагенеза или через спонтанные мутации. Штаммы с сопротивлением могут избежать выбора, блокируя, экспортируяили унижая аналоги 5. Еще одной проблемой является токсические побочные эффекты аналогов на другие клеточные процессы7. Как следствие, штаммы, которые выживают аналоговый выбор не может быть аминокислоты overproducers, в то время как желаемые overproducers могут быть ложно уничтожены из-за негативных побочных эффектов.
Здесь представлена новая стратегия, основанная на законе о предвзятом отношении кодона, с тем чтобы добиться точной и быстрой идентификации аминокислотных перепроизводителей. Большинство аминокислот кодируются более чем одним нуклеотидным триплетом, которыйпо-разному благоприятствует организмам-хозяину 8,9. Некоторые кодоны редко используются в последовательности кодирования и называются редкими кодонами. Их переводы в аминокислоты опираются на коньяк tRNAs, которые несут соответствующие аминокислоты. Тем не менее, tRNAs, которые признают редкие кодоны обычно имеют гораздо меньше изобилия, чем tRNAs общих кодонов10,11. Следовательно, эти редкие tRNAs менее вероятно, чтобы захватить свободные аминокислоты в соревнованиях с другими изоастои, и переводы редких кодон-богатых последовательностей начинают замедляться или даже прекращаются, когда количество аминокислот ограничено 10. Переводы теоретически могут быть восстановлены, если есть избыток аминокислот после зарядки синонимных общих tRNAs из-за перепроизводства или дополнительных кормлений соответствующих аминокислот12. Если редкий богатый кодоном ген кодирует маркер выбора или скрининга, штаммы, демонстрирующие соответствующие фенотипы, могут быть легко идентифицированы и, вероятно, являются перепроизводителями целевых аминокислот.
Вышеупомянутая стратегия применяется для создания системы отбора и скрининга для идентификации производителей аминокислот. Система отбора использует гены устойчивости к антибиотикам (например, kanR) в качестве маркеров, в то время как система скрининга использует гены, кодирующие флуоресцентные (например, зеленый флуоресцентный белок (GFP) или хромагенные (например, PrancerPurple) белки. Гены маркеров в обеих системах модифицируются путем замены определенных чисел общих кодонов для целевой аминокислоты на ее синонимную редкую альтернативу. Штаммы в библиотеке мутаций, которые гавани редких кодон богатых маркер гена отбираются или скрининга при надлежащих условиях, и overproducers целевых аминокислот могут быть легко определены. Рабочий процесс начинается со построения редко-кодон-богатых маркера генной системы, а затем оптимизации условий труда, а затем выявление и проверка аминокислоты overproducers. Эта аналогово-независимая стратегия основана на догме в переводе белков и была практически проверена для точной и быстрой идентификации аминокислотных перепроизводителей. Теоретически, он может быть непосредственно использован для аминокислот с редкими кодонами и для всех микроорганизмов. В целом стратегия на основе редкого кодона послужит эффективной альтернативой традиционному аналоговому подходу, когда отсутствуют надлежащие аналоги конкретных аминокислот или когда главной проблемой является высокая уровень ложного положительного уровня. Протокол ниже использует лейцин редкий кодон, чтобы продемонстрировать эту стратегию в выявлении Escherichia coli L-leucine overproducers.
Protocol
Representative Results
Discussion
Количество редких кодонов в генах маркеров и среда отбора или скрининга имеют решающее значение для ингибирования белковых выражений из редко-кодон-модифицированных генов маркера. Если не может быть обнаружено существенное различие между протеиновыми экспрессиями генов дикого типа …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (грант No 21676026), Национальной программой научных исследований и разработок Китая (грант No 2017YFD0201400) и Китайским фондом постдокторской науки (грант No 2017M620643). Работы в Институте развития UCLA (Сучжоу) были поддержаны внутренними грантами из провинции Цзянсу и индустриального парка Сучжоу.
Materials
| Acetonitrile | Thermo | 51101 | |
| EasyPure HiPure Plasmid MiniPrep Kit | Transgen | EM111-01 | |
| EasyPure Quick Gel Extraction Kit | Transgen | EG101-01 | |
| Gibson assembly master mix | NEB | E2611S | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Solarbio | I8070 | |
| L-leucine | Sigma | L8000 | |
| Microplate reader | Biotek | Synergy 2 | |
| n-hexane | Thermo | H3061 | |
| Phenyl isothiocyanate | Sigma | P1034 | |
| PrancerPurple CPB-37-441 | ATUM | CPB-37-441 | |
| TransStar FastPfu Fly DNA polymerase | Transgen | AP231-01 | |
| Triethylamine | Sigma | T0886 | |
| Ultra-high performance liquid chromatography | Agilent | 1290 Infinity II | |
| Wild type C. glutamicum | ATCC | 13032 | |
| XL10-Gold E. coli competent cell | Agilent | 200314 | |
| ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 column | Agilent | 959759-902K |
References
- Tatsumi, N., Inui, M. . Corynebacterium glutamicum: biology and biotechnology. , (2012).
- Tonouchi, N., Ito, H., Yokota, A., Ikeda, M. Present global situation of amino acids in industry. Amino Acid Fermentation. , 3-14 (2017).
- Gusyatiner, M., Lunts, M., Kozlov, Y., Ivanovskaya, L., Voroshilova, E. . DNA coding for mutant isopropylmalate synthase, L-leucine-producing microorganism and method for producing L-leucine. , (2005).
- Park, J. H., Lee, S. Y. Towards systems metabolic engineering of microorganisms for amino acid production. Current Opinion in Biotechnology. 19 (5), 454-460 (2008).
- Norris, R., Lea, P. The use of amino acid analogues in biological studies. Science Progress. , 65-85 (1976).
- Park, J. H., Lee, S. Y. Fermentative production of branched chain amino acids: a focus on metabolic engineering. Applied Microbiology and Biotechnology. 85 (3), 491-506 (2010).
- Bach, T. M., Takagi, H. Properties, metabolisms, and applications of L-proline analogues. Applied Microbiology and Biotechnology. 97 (15), 6623-6634 (2013).
- Crick, F. H. C. On the genetic code. Science. 139 (3554), 461-464 (1963).
- Plotkin, J. B., Kudla, G. Synonymous but not the same: the causes and consequences of codon bias. Nature Reviews Genetics. 12 (1), 32-42 (2011).
- Dittmar, K. A., Sørensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino‐acid starvation. EMBO Reports. 6 (2), 151-157 (2005).
- Elf, J., Nilsson, D., Tenson, T., Ehrenberg, M. Selective charging of tRNA isoacceptors explains patterns of codon usage. Science. 300 (5626), 1718-1722 (2003).
- Sørensen, M. A. Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel+ and Rel− strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy. Journal of Molecular Biology. 307 (3), 785-798 (2001).
- Zheng, B., et al. Utilization of rare codon-rich markers for screening amino acid overproducers. Nature Communications. 9 (1), 3616 (2018).
- Richardson, S. M., Wheelan, S. J., Yarrington, R. M., Boeke, J. D. GeneDesign: rapid, automated design of multikilobase synthetic genes. Genome Research. 16 (4), 550-556 (2006).
- Xiong, A. -. S., et al. PCR-based accurate synthesis of long DNA sequences. Nature Protocols. 1 (2), 791-797 (2006).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).
- Cohen, S. A., Bidlingmeyer, B. A., Tarvin, T. L. PITC derivatives in amino acid analysis. Nature. 320 (6064), 769-770 (1986).
- Zhou, J., Liu, W. J., Peng, S. W., Sun, X. Y., Frazer, I. Papillomavirus capsid protein expression level depends on the match between codon usage and tRNA availability. Journal of Virology. 73 (6), 4972-4982 (1999).
- Gregg, C. J., et al. Rational optimization of tolC as a powerful dual selectable marker for genome engineering. Nucleic Acids Research. 42 (7), 4779-4790 (2014).
- Pelicic, V., Reyrat, J. M., Gicquel, B. Expression of the Bacillus subtilis sacB gene confers sucrose sensitivity on mycobacteria. Journal of Bacteriology. 178 (4), 1197-1199 (1996).
- Avcilar-Kucukgoze, I., et al. Discharging tRNAs: a tug of war between translation and detoxification in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 44 (17), 8324-8334 (2016).
- Mundhada, H., Schneider, K., Christensen, H. B., Nielsen, A. T. Engineering of high yield production of L-serine in Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering. 113 (4), 807-816 (2016).
- Makosky, P. C., Dahlberg, A. E. Spectinomycin resistance at site 1192 in 16S ribosomal RNA of E. coli: an analysis of three mutants. Biochimie. 69 (8), 885-889 (1987).
- Feng, L., Tumbula-Hansen, D., Toogood, H., Söll, D. Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single amino acid change. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5676-5681 (2003).
- Naganuma, M., et al. The selective tRNA aminoacylation mechanism based on a single G• U pair. Nature. 510 (7506), 507 (2014).
- Hoesl, M. G., et al. Chemical evolution of a bacterial proteome. Angewandte Chemie International Edition. 54 (34), 10030-10034 (2015).
- Hershberg, R., Petrov, D. A. Selection on codon bias. Annual Review of Genetics. 42, 287-299 (2008).
- Huo, Y. -. X., et al. Conversion of proteins into biofuels by engineering nitrogen flux. Nature Biotechnology. 29, 346 (2011).
