Identifiera aminosyran Överproducenter med hjälp av sällsynta-Codon-rika markörer
Summary
Denna studie presenterar en alternativ strategi för konventionell toxisk analog-baserad metod för att identifiera aminosyra överproducenter med hjälp av sällsynta-Codon-rika markörer för att uppnå noggrannhet, känslighet och hög genomströmning samtidigt.
Abstract
För att tillfredsställa den ständigt växande marknaden för aminosyror, hög prestanda produktions stammar behövs. De Amino Acid överproducenterna identifieras konventionellt genom att utnyttja tävlingar mellan aminosyror och deras analoger. Emellertid, denna analoga-baserade metoden är av låg noggrannhet, och korrekt analoger för specifika aminosyror är begränsade. Här presenterar vi en alternativ strategi som möjliggör en noggrann, känslig och hög genomströmning screening av aminosyran överproducenter med hjälp av sällsynta-Codon-rika markörer. Denna strategi är inspirerad av fenomenet kodon användning bias i protein översättning, som kodons kategoriseras i vanliga eller sällsynta sådana baserat på deras frekvenser av förekomst i kodning DNA. Översättningen av sällsynta kodons beror på deras motsvarande sällsynta överföring rnas (tRNAs), som inte kan laddas helt av den besläktat aminosyror under svält. Teoretiskt kan den sällsynta tRNAs laddas om det finns ett överskott av aminosyrorna efter laddning av synonyma vanliga isoacceptorer. Därför, fördröjda översättningar orsakade av sällsynta kodons kunde återställas genom utfodring eller intracellulära överproduktioner av motsvarande aminosyror. Enligt detta antagande, ett urvals-eller screening system för att identifiera aminosyra överproducenter fastställs genom att ersätta de gemensamma kodons av de riktade aminosyror med sina synonyma sällsynta alternativ i antibiotikaresistens gener eller gener kodning av fluorescerande eller kromogena proteiner. Vi visar att proteinhalten kan hindras kraftigt av införlivandet av sällsynta kodons och att nivåerna av proteiner korrelerar positivt med aminosyrekoncentrationerna. Med hjälp av detta system kan överproducenter av flera aminosyror lätt screenas ut från Mutations bibliotek. Denna sällsynta-kodon-baserade strategi kräver bara en enda modifierad gen, och värden är mindre benägna att undkomma urvalet än i andra metoder. Det erbjuder en alternativ metod för att få aminosyran överproducenter.
Introduction
Den nuvarande produktionen av aminosyror är starkt beroende av jäsning. Men de titrar och avkastningen för de flesta aminosyra produktions stammar är lägre än de stigande kraven på den globala aminosyran marknaden som är värd miljarder dollar1,2. Att få högpresterande aminosyra överproducenter är avgörande för uppgraderingen av aminosyran industrin.
Traditionell strategi för att identifiera aminosyran överproducenter utnyttjar tävlingar mellan aminosyror och deras analoger i proteinsyntes3,4. Dessa analoger kan ladda tRNAs som erkänner motsvarande aminosyror och därmed hämma förlängningen av peptidkedjor, vilket leder till arresterad tillväxt eller celldöd5. Ett sätt att motstå de analoga påfrestningarna är att öka koncentrationerna av intracellulära aminosyror. De berikade aminosyrorna kommer att konkurrera ut de analoger för den ändliga tRNAs och säkerställa en korrekt syntes av funktionella proteiner. Därför, stammar som överlever de analoger kan väljas och är sannolikt överproducenterna av motsvarande aminosyror.
Även visat sig vara framgångsrik i valet av överproducenter för aminosyror såsom L-leucine6, den analoga-baserade strategin lider av allvarliga nackdelar. Ett stort bekymmer är det analoga motståndet som härstammar från processen med mutagenes eller genom spontana mutationer. Stammar med resistens kan undgå urvalet genom att blockera, exportera eller försämra den analoger5. Ett annat bekymmer är de giftiga biverkningarna av analoger på andra cellulära processer7. Som en följd, stammar som överlever den analoga urvalet kan inte vara aminosyran överproducenter, medan de önskade överproducenterna kan vara falskt utrotade på grund av de negativa biverkningarna.
Här presenteras en ny strategi som bygger på lagen i kodon bias för att uppnå noggranna och snabba identifieringar av aminosyra överproducenter. Mest amino syror kodas av mer än en nukleotid tripleten som gynnas olikt av värdorganismerna8,9. Vissa kodons används sällan i kodning sekvenser och kallas sällsynta kodons. Deras översättningar till aminosyror förlitar sig på den besläktat tRNAs som bär motsvarande aminosyror. TRNAs som känner igen sällsynta kodon har dock vanligtvis mycket lägre abundans än tRNAs i den gemensamma kodons10,11. Följaktligen är dessa sällsynta tRNAs mindre benägna att fånga de fria aminosyrorna i tävlingarna med andra isoacceptorer, och översättningar av de sällsynta-Codon-rika sekvenserna börjar bromsa eller till och med avslutas när mängden aminosyror är begränsade 10. översättningarna kan, teoretiskt, återställas om det finns en aminosyra överskott efter laddning av synonyma gemensamma tRNAs på grund av overproductions eller extra matning av motsvarande aminosyror12. Om den sällsynta-kodon-rika genen kodar en urvals-eller screening markör, kan stammar som uppvisar motsvarande fenotyper sedan lätt identifieras och är sannolikt överproducenterna av de riktade aminosyrorna.
Strategin ovan tillämpas för att fastställa ett urval och ett screening system för identifiering av överproducenter av aminosyror. Urvals systemet använder gener för antibiotikaresistens (t. ex. kanR) som markörer medan screening systemet använder de gener som kodar för fluorescerande (t. ex. grönt fluorescerande protein [GFP]) eller kromogent (t. ex. prancerpurple) proteiner. Markörerna gener i båda systemen modifieras genom att ersätta definierade nummer av de gemensamma kodons för den riktade aminosyran med dess synonymt sällsynt alternativ. Stammar i Mutations biblioteket som hyser den sällsynta-kodon-rika markör genen väljs eller screenas under lämpliga förhållanden, och överproducenterna av de riktade aminosyrorna kan lätt identifieras. Arbetsflödet börjar med byggandet av sällsynta-Codon-rika markörgen systemet, följt av optimering av arbetsförhållanden, och sedan identifiering och verifiering av aminosyran överproducenter. Denna analoga-oberoende strategi är baserad på dogmen i protein översättning och har praktiskt taget verifierats för att möjliggöra noggranna och snabba identifieringar av aminosyra överproducenter. Teoretiskt, det kan vara direkt anställd till aminosyror med sällsynta kodons och till alla mikroorganismer. I alla, den sällsynta-kodon-baserade strategin kommer att fungera som ett effektivt alternativ till den konventionella analoga-baserade metoden när korrekt analoger för specifika aminosyror är otillgängliga, eller när en hög falsk positiv ränta är den stora oro. Protokollet nedan använder leucin sällsynt kodon att demonstrera denna strategi för att identifiera Escherichia coli L-leucin överproducenter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Antalet sällsynta kodons i markörgener och urvalet eller screening mediet är avgörande för att hämma proteinuttryck från de sällsynta-kodon-modifierade markörgener. Om ingen signifikant skillnad kan påvisas mellan proteinuttryck från Wild-typ markörerna gener och deras derivat, öka antalet sällsynta kodons eller använda ett näringsämne-begränsat medium kan förstärka skillnaderna. Men om hämnings effekten är för stark, kan proteinhalten inte återvinnas även genom extra matning av motsvarande amino…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Verket stöddes gemensamt av Kinas National Natural Science Foundation (Grant nr 21676026), Kinas nationella nyckel R & D-program (Grant No. 2017YFD0201400), och China postdoc Science Foundation (Grant No. 2017M620643). Verk i UCLA Institute of avancemang (Suzhou) stöddes av de interna bidragen från Jiangsu-provinsen och Suzhou Industrial Park.
Materials
| Acetonitrile | Thermo | 51101 | |
| EasyPure HiPure Plasmid MiniPrep Kit | Transgen | EM111-01 | |
| EasyPure Quick Gel Extraction Kit | Transgen | EG101-01 | |
| Gibson assembly master mix | NEB | E2611S | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Solarbio | I8070 | |
| L-leucine | Sigma | L8000 | |
| Microplate reader | Biotek | Synergy 2 | |
| n-hexane | Thermo | H3061 | |
| Phenyl isothiocyanate | Sigma | P1034 | |
| PrancerPurple CPB-37-441 | ATUM | CPB-37-441 | |
| TransStar FastPfu Fly DNA polymerase | Transgen | AP231-01 | |
| Triethylamine | Sigma | T0886 | |
| Ultra-high performance liquid chromatography | Agilent | 1290 Infinity II | |
| Wild type C. glutamicum | ATCC | 13032 | |
| XL10-Gold E. coli competent cell | Agilent | 200314 | |
| ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 column | Agilent | 959759-902K |
References
- Tatsumi, N., Inui, M. . Corynebacterium glutamicum: biology and biotechnology. , (2012).
- Tonouchi, N., Ito, H., Yokota, A., Ikeda, M. Present global situation of amino acids in industry. Amino Acid Fermentation. , 3-14 (2017).
- Gusyatiner, M., Lunts, M., Kozlov, Y., Ivanovskaya, L., Voroshilova, E. . DNA coding for mutant isopropylmalate synthase, L-leucine-producing microorganism and method for producing L-leucine. , (2005).
- Park, J. H., Lee, S. Y. Towards systems metabolic engineering of microorganisms for amino acid production. Current Opinion in Biotechnology. 19 (5), 454-460 (2008).
- Norris, R., Lea, P. The use of amino acid analogues in biological studies. Science Progress. , 65-85 (1976).
- Park, J. H., Lee, S. Y. Fermentative production of branched chain amino acids: a focus on metabolic engineering. Applied Microbiology and Biotechnology. 85 (3), 491-506 (2010).
- Bach, T. M., Takagi, H. Properties, metabolisms, and applications of L-proline analogues. Applied Microbiology and Biotechnology. 97 (15), 6623-6634 (2013).
- Crick, F. H. C. On the genetic code. Science. 139 (3554), 461-464 (1963).
- Plotkin, J. B., Kudla, G. Synonymous but not the same: the causes and consequences of codon bias. Nature Reviews Genetics. 12 (1), 32-42 (2011).
- Dittmar, K. A., Sørensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino‐acid starvation. EMBO Reports. 6 (2), 151-157 (2005).
- Elf, J., Nilsson, D., Tenson, T., Ehrenberg, M. Selective charging of tRNA isoacceptors explains patterns of codon usage. Science. 300 (5626), 1718-1722 (2003).
- Sørensen, M. A. Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel+ and Rel− strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy. Journal of Molecular Biology. 307 (3), 785-798 (2001).
- Zheng, B., et al. Utilization of rare codon-rich markers for screening amino acid overproducers. Nature Communications. 9 (1), 3616 (2018).
- Richardson, S. M., Wheelan, S. J., Yarrington, R. M., Boeke, J. D. GeneDesign: rapid, automated design of multikilobase synthetic genes. Genome Research. 16 (4), 550-556 (2006).
- Xiong, A. -. S., et al. PCR-based accurate synthesis of long DNA sequences. Nature Protocols. 1 (2), 791-797 (2006).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).
- Cohen, S. A., Bidlingmeyer, B. A., Tarvin, T. L. PITC derivatives in amino acid analysis. Nature. 320 (6064), 769-770 (1986).
- Zhou, J., Liu, W. J., Peng, S. W., Sun, X. Y., Frazer, I. Papillomavirus capsid protein expression level depends on the match between codon usage and tRNA availability. Journal of Virology. 73 (6), 4972-4982 (1999).
- Gregg, C. J., et al. Rational optimization of tolC as a powerful dual selectable marker for genome engineering. Nucleic Acids Research. 42 (7), 4779-4790 (2014).
- Pelicic, V., Reyrat, J. M., Gicquel, B. Expression of the Bacillus subtilis sacB gene confers sucrose sensitivity on mycobacteria. Journal of Bacteriology. 178 (4), 1197-1199 (1996).
- Avcilar-Kucukgoze, I., et al. Discharging tRNAs: a tug of war between translation and detoxification in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 44 (17), 8324-8334 (2016).
- Mundhada, H., Schneider, K., Christensen, H. B., Nielsen, A. T. Engineering of high yield production of L-serine in Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering. 113 (4), 807-816 (2016).
- Makosky, P. C., Dahlberg, A. E. Spectinomycin resistance at site 1192 in 16S ribosomal RNA of E. coli: an analysis of three mutants. Biochimie. 69 (8), 885-889 (1987).
- Feng, L., Tumbula-Hansen, D., Toogood, H., Söll, D. Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single amino acid change. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5676-5681 (2003).
- Naganuma, M., et al. The selective tRNA aminoacylation mechanism based on a single G• U pair. Nature. 510 (7506), 507 (2014).
- Hoesl, M. G., et al. Chemical evolution of a bacterial proteome. Angewandte Chemie International Edition. 54 (34), 10030-10034 (2015).
- Hershberg, R., Petrov, D. A. Selection on codon bias. Annual Review of Genetics. 42, 287-299 (2008).
- Huo, Y. -. X., et al. Conversion of proteins into biofuels by engineering nitrogen flux. Nature Biotechnology. 29, 346 (2011).
