En strategi til identificering af forbindelser, der påvirker cellevækst og overlevelse i dyrkede pattedyrceller ved lav til moderat gennemløb
Summary
Det er ofte nødvendigt at vurdere den potentielle cytotoksicitet af et sæt forbindelser på dyrkede celler. Her beskriver vi en strategi for pålideligt at screene for giftige forbindelser i et 96-Well-format.
Abstract
Cytotoksicitet er en kritisk parameter, der skal kvantificeres, når man studerer lægemidler, der kan have terapeutiske fordele. På grund af dette, mange Drug screening assays udnytte cytotoksicitet som en af de kritiske egenskaber, der skal profileret for individuelle forbindelser. Celler i kultur er en nyttig model til at vurdere cytotoksicitet før du fortsætter med at følge op på lovende bly forbindelser i dyrere og arbejdskrævende dyremodeller. Vi beskriver en strategi for at identificere forbindelser, der påvirker cellevækst i en tdTomato udtrykker humane neurale stamceller (NSC) linje. Strategien bruger to komplementære assays til at vurdere celle nummer. En analyse virker via reduktion af 3-(4,5-dimethylthizol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid (MTT) til formazan som en proxy for celle nummer og den anden direkte tæller tdTomato udtrykker NSCs. De to assays kan udføres samtidigt i et enkelt eksperiment og er ikke arbejdskraftintensive, hurtige og billige. Den strategi, der er beskrevet i denne demonstration testede 57 forbindelser i en sonderende primær skærm for toksicitet i en 96-brønd plade format. Tre af de hits blev karakteriseret yderligere i en seks-punkts dosisrespons ved hjælp af den samme analyse set-up som den primære skærm. Ud over at give fremragende bekræftelse for toksicitet, sammenligning af resultaterne fra de to analyser kan være effektiv til at identificere forbindelser, der påvirker andre aspekter af cellevækst.
Introduction
En af de vigtigste egenskaber, der skal bestemmes for en kemisk forbindelse, der har terapeutisk potentiale er dens toksicitet for animalske celler. Denne Karakteristik vil afgøre, om et lægemiddel er en god kandidat til mere omfattende undersøgelse. I de fleste tilfælde, forbindelser med minimal toksicitet er søgt, men der er situationer, hvor en forbindelse med kapacitet til at dræbe specifikke celletyper er af interesse, f. eks, anti-tumorigenic narkotika. Selv om hele dyr er de bedste modelsystemer til at bestemme systemisk toksicitet, omkostninger og arbejdskraft er prohibitiv, når mere end et par forbindelser skal testes. Da en sådan pattedyrscelle kultur generelt anvendes som det mest effektive alternativ1,2. Små til medium gennemstrømning narkotika skærme er en vigtig modalitet, hvorigennem toksicitet kan vurderes i cellekultur. Disse skærme kan bruges til at afhøre kommenterede biblioteker, der er rettet mod individuelle signalering-veje. Det generelle format af en sådan skærm er først at teste alle forbindelser i biblioteket ved en enkelt dosis (generelt 10 μM) i en sonderende primær toksicitet skærm, og derefter udføre en dybtgående sekundær dosisrespons skærm til fuldt ud at karakterisere toksiciteten profil af hits fra den primære skærm. Metoderne til at gennemføre denne strategi vil blive beskrevet her og give en hurtig, effektiv og billig måde at identificere og karakterisere giftige forbindelser.
Flere metoder er blevet udviklet til at vurdere cytotoksicitet af små forbindelser og nanomateriale i pattedyrsceller3,4. Det skal bemærkes, at visse materialer kan interagere med analysen giver misvisende resultater, og sådanne interaktioner bør testes, når karakterisering hits fra toksicitet skærme4. Cytotoksiske assays omfatter trypan og et blå udelukkelse5, lactat dehydrogenase (LDH) frigivelse assay6, Alamar blå assay7, calcien acetoxymethylester (am)8, og ATP assay9. Alle disse assays måle forskellige aspekter af cellemetabolisme, som kan tjene som en proxy for celle nummer. Mens alle tilbyder fordele, tetrazolium salt-baserede assays såsom 3-(4,5-dimethylthizol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT), 2,3-bis (2-methoxy-4-Nitro-5-sulfopheny)-2H-tetrazolium-5-carboxyanilide indre salt (XTT)-1, og 4-(3-[4- Iodophenyl]-2-[4-nitrophenyl]-2H-5-tetrazolio)-1, 3-benzen disulfonat (WST-1)10,11 giver god nøjagtighed og brugervenlighed til lave omkostninger. MTT, som vil blive anvendt i denne demonstration, er reduceret til en uopløselig formazan af en mitokondriel reduktase og hastigheden af denne omdannelse korrelerer stærkt med celle nummer. Denne analyse er blevet rutinemæssigt udnyttet i både en lille skala og til screening biblioteker med op til 2.000 forbindelser12. Direkte optælling af celler med en mærket markør tilbyder en anden metode til at vurdere cellernes nummer, og i modsætning til MTT-analysen kan det give yderligere oplysninger om dynamikken i cellulær vækst. Flere offentligt tilgængelige algoritmer er tilgængelige til at udføre automatiserede celletal analyser, og der er også proprietære algoritmer, der er en del af softwarepakker til billedbehandlings læsere13,14. I denne metodebeskrivelse, en human neurale stamcelle (NSC) linje, der er blevet genetisk redigeret til konstitutivt Express tdTomato15 vil tjene som en test linje til at sammenligne cellulære levedygtighed resultater mellem en MTT assay og en automatiseret celletælling analyse i en skærm, der vurderer toksiciteten af 57 test forbindelser. Selv om hovedformålet med denne strategi var at identificere og karakterisere giftige forbindelser, det har den yderligere fordel af potentielt identificere væksthæmmende og vækstfremmende forbindelser og dermed giver en effektiv metode til at identificere narkotika der kan moduere cellulære vækst.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hovedformålet med denne artikel var at beskrive en strategi, som effektivt og billigt kunne identificere forbindelser, der påvirker cellevækst i en lav-til moderat-gennemløb screening. To ortogonale teknikker blev udnyttet til at vurdere celle nummer for at øge tilliden til konklusionerne og tilbyde yderligere indsigt, der ikke ville være til rådighed, hvis kun en enkelt analyse blev brugt. En af de assays brugte en fluorescerende celle Imager til direkte tælle tdTomato-positive celler og den anden var afhængig …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af NINDS Intramural Research program.
Materials
| B-27 (50X) | ThermoFisher Scientific | 17504001 | Neural stem cell medium component. |
| BenchTop pipettor | Sorenson Bioscience | 73990 | Provides ability to pipette compound library into a 96-well plate in one shot. |
| BioLite 96 well multidish | Thermo Scientific | 130188 | Any 96 well cell culture plate will work. We use these in our work. |
| Cell culture microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Visual inspection of cells to ensure proper density. |
| Cytation 5/ Imaging reader | BioTek | CYT3MFV | Used for cell imaging and absorbance readings. |
| DMSO | Fisher Scientific | 610420010 | Solvent for compounds used in screen. Dissolves MTT precipitates to facilitate absorbance measurements. |
| FGF-basic | Peprotech | 100-18B | Neural stem cell medium component. |
| GelTrex | ThermoFisher Scientific | A1413202 | Neural stem cell basement membrane matrix. Allows cells to attach to cell culture plates. |
| Gen5 3.04 | BioTek | Analysis software to determine cell counts for tdTomato expressing cells. | |
| Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | Neural stem cell medium component. |
| Microtest U-Bottom | Becton Dickinson | 3077 | Storage of compound libraries. |
| MTT | ThermoFisher Scientific | M6494 | Active assay reagent to determine cellular viability. |
| Multichannel pippette | Rainin | E8-1200 | Column-by-column addition of cell culture medium, MTT, or DMSO. |
| Neurobasal medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | Neural stem cell base medium. |
| RFP filter cube | BioTek | 1225103 | Filter in Cytation 5 used to image tdTomato expressing cells. |
| TrypLE | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Cell dissociation reagent. |
References
- National Research Council. . Toxicity Testing in the 21st century: A Vision and a Strategy. , (2007).
- Llorens, J., Li, A. A., Ceccatelli, S., Sunol, C. Strategies and tools for preventing neurotoxicity: to Test, to predict, and how to do it. Neurotoxicology. 33 (4), 796-804 (2012).
- Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. Cell proliferation and cytotoxicity assays. Current Pharmaceutical Biotechnology. 17 (14), 1213-1221 (2016).
- Ciofani, G., Danti, S., D’Alessandro, D., Moscato, S., Menciassi, A. Assessing cytotoxicity of boron nitride nanotubes: interference with the MTT assay. Biochemical and Biophysical Research Communications. 394 (2), 405-411 (2010).
- Tennant, J. R. Evaluation of the trypan blue technique for determination of cell viability. Transplantation. 2 (6), 685-694 (1964).
- Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 64 (3), 313-320 (1983).
- Ahmed, S. A., Gogal, R. M., Walsh, J. E. A new rapid and simple nonradioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine incorporation assay. Journal of Immunological Methods. 170 (2), 211-224 (1994).
- Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: Standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).
- Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).
- Malik, N., et al. Compounds with species and cell type specific toxicity identified in a 2000 compound drug screen of neural stem cells and rat mixed cortical neurons. Neurotoxicology. 45, 192-200 (2014).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), 100 (2006).
- Cerbini, T., et al. Transcription activator-like effector nuclease (TALEN)-mediated CLYBL targeting enables enhanced transgene expression and one-step generation of dual reporter human induced pluriopotent stem cell (iPSC) and neural stem cell (NSC) lines. PLoS One. 10 (1), 0116032 (2015).
- Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
- Qie, S., et al. Glutamine depletion and glucose depletion trigger growth inhibition via distinctive gene expression reprogramming. Cell Cycle. 11 (19), 3679-3690 (2012).
- Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells. Scientific Reports. 8 (1), 3029 (2018).
- Carmichael, J., DeGraff, W. G., Gazdar, A. F., Minna, J. D., Mitchell, J. B. Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing. Cancer Research. 47 (4), 936-942 (1987).
- Romijn, J. C., Verkoelen, C. F., Schroeder, F. H. Application of the MTT assay to human prostate cancer cell lines in vitro: establishment of test conditions and assessment of hormone-stimulated growth and drug-induced cytostatic and cytotoxic effects. Prostate. 12 (1), 99-110 (1988).
- Jo, H. Y., et al. The unreliability of MTT assay in the cytotoxic test of primary cultured glioblastoma cells. Experimental Neurobiology. 24 (3), 235-245 (2015).
- Kalinina, M. A., Skvortsov, D. A., Rubtsova, M. P., Komarova, E. S., Dontsova, O. A. Cytotoxicity test based on human cells labeled with fluorescent proteins: photography, and scanning for high-throughput assay. Molecular Imaging and Biology. 20 (3), 368-377 (2018).
