Düşük-Orta Throughput'ta Kültürlü Memeli Hücrelerinde Hücre Büyümesini ve SağkalımLarını Etkileyen Bileşikleri Belirleme Stratejisi
Summary
Genellikle kültürlü hücreler üzerinde bileşiklerin bir dizi potansiyel sitotoksisite değerlendirmek için gereklidir. Burada, 96-iyi formatında toksik bileşikler için güvenilir bir tarama stratejisi açıklar.
Abstract
Sitotoksisite terapötik yararları olabilir ilaçlar çalışırken ölçülmesi gereken kritik bir parametredir. Bu nedenle, birçok ilaç tarama tahlilleri tek tek bileşikler için profilli kritik özelliklerinden biri olarak sitotoksisite kullanmak. Kültür hücreleri daha pahalı ve emek yoğun hayvan modellerinde umut verici kurşun bileşikleri takip geçmeden önce sitotoksisite değerlendirmek için yararlı bir modeldir. İnsan nöral kök hücreleri (NSC) hattında hücre büyümesini etkileyen bileşikleri belirlemek için bir strateji tanımlıyoruz. Strateji, hücre numarasını değerlendirmek için iki tamamlayıcı tahlil kullanır. Bir tsay 3-(4,5-dimethylthizol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromür (MTT) hücre numarası için bir proxy olarak formazan azaltılması ile çalışır ve diğer doğrudan tdTomato ifade NSCs sayar. İki tahlil tek bir deneyde aynı anda yapılabilir ve emek yoğun, hızlı ve ucuz değildir. Bu gösteride açıklanan strateji 96-iyi plaka formatında toksisite için bir keşif birincil ekranda 57 bileşikler test etti. Üç isabet birincil ekran olarak aynı testi set-up kullanarak altı noktalı doz yanıtı daha karakterize edildi. Toksisite için mükemmel doğrulama sağlamanın yanı sıra, iki tahlil sonuçlarının karşılaştırılması hücre büyümesinin diğer yönlerini etkileyen bileşiklerin belirlenmesinde etkili olabilir.
Introduction
Terapötik potansiyeli olan bir kimyasal bileşik için belirlenmesi gereken en önemli özelliklerinden biri hayvan hücrelerine toksisitesidir. Bu özellik bir ilaç daha kapsamlı bir çalışma için iyi bir aday olup olmadığını belirleyecektir. Çoğu durumda, minimal toksisite ile bileşikler aranır ama belirli hücre türlerini öldürmek için kapasiteye sahip bir bileşik ilgi olduğu durumlar vardır, örneğin, anti-tümörijenik ilaçlar. Tüm hayvanlar sistemik toksisiteyi belirlemek için en iyi model sistemler olmasına rağmen, maliyet ve işçilik dahil birkaç bileşikler den fazla test edilmesi gerektiğinde engelleyicidir. Bu tür memeli hücre kültürü genellikle en verimli alternatif olarak kullanılır1,2. Küçük ve orta ölçekli ilaç ekranları, hücre kültüründe toksisitenin değerlendirilebileceği önemli bir yöntemdir. Bu ekranlar, tek tek sinyal yollarını hedefleyen açıklamalı kitaplıkları sorgulamak için kullanılabilir. Böyle bir ekranın genel biçimi başlangıçta tek bir dozda kütüphanedeki tüm bileşikleri test etmektir (genellikle 10 μM) bir keşif birincil toksisite ekranında, ve sonra tam toksisite karakterize etmek için derinlemesine bir ikincil doz yanıt ekranı gerçekleştirmek birincil ekrandan isabet profili. Bu stratejiyi uygulamak için yöntemler burada açıklanacaktır ve toksik bileşikleri tanımlamak ve karakterize etmek için hızlı, verimli ve ucuz bir yol sağlar.
Memeli hücrelerinde küçük bileşiklerin ve nanomateryalin sitotoksisitesini değerlendirmek için birden fazla yöntem geliştirilmiştir3,4. Bazı malzemelerin yanıltıcı sonuçlar sağlayan tahkikat ile etkileşime girebileceği unutulmamalıdır ve bu tür etkileşimler toksisite ekranlarından isabet karakterize ederken test edilmelidir4. Sitotoksisite tahlilleri trypan mavi dışlamaiçerir 5, laktat dehidrogenaz (LDH) serbest tahlil6, Alamar mavi tahlil7, kalsin asetoksimtil ester (AM)8, ve ATP tahlil9. Tüm bu tahliller hücre numarası için bir proxy olarak hizmet verebilir hücre metabolizmasının çeşitli yönlerini ölçmek. Tüm faydalar sunarken, tetrazolium tuz bazlı tahliller 3-(4,5-dimethylthizol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium bromür (MTT), 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfopheny)-2H-tetrazolium-5-karboksiyanilid iç tuz (XTT)-1, ve 4-4-4-4-4-4-[ İyodofenil]-2-[4-nitrofenil]-2H-5-tetrazolio)-1,3-benzen disülfür (WST-1)10,11 düşük maliyetle iyi doğruluk ve kullanım kolaylığı sağlar. Bu gösteride kullanılacak olan MTT, mitokondriyal redüktaz ile çözünmez formazan’a indirgenir ve bu dönüşüm oranı hücre sayısı ile güçlü bir şekilde ilişkilidir. Bu titrek rutin olarak hem küçük ölçekte hem de 2.000 bileşiğin12’yekadar olduğu tarama kütüphanelerinde kullanılmaktadır. Hücrelerin etiketli bir işaretçi tarafından doğrudan sayma hücresel sayıyı değerlendirmek için başka bir yöntem sunar ve MTT tsay aksine hücresel büyüme dinamikleri hakkında ek bilgi sağlayabilir. Birkaç kamuya açık algoritmalar otomatik hücre sayısı analizleri gerçekleştirmek için kullanılabilir ve görüntüleme okuyucuları için yazılım paketlerinin bir parçası olan özel algoritmalar da vardır13,14. Bu yöntem açıklamasında, genetik olarak tdTomato15’i ifade etmek için düzenlenmiş bir insan nöral kök hücresi (NSC) hattı, MTT tahlilleri ile otomatik hücre sayımı arasındaki hücresel canlılık sonuçlarını karşılaştırmak için bir test hattı görevi göreceksiniz. 57 test bileşiğinin toksisitesini değerlendiren bir ekranda test edin. Bu stratejinin birincil amacı toksik bileşikleri belirlemek ve karakterize etmek olmasına rağmen, potansiyel olarak büyüme inhibitörü ve büyüme arttırıcı bileşikleri belirleme nin ek yararına sahiptir ve böylece ilaçların tanımlanması için etkili bir yöntem sağlar hücresel büyümeyi modüle edebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makalenin temel amacı, düşük ila orta verimli taramada hücre büyümesini etkileyen bileşikleri verimli ve ucuz bir şekilde tanımlayabilecek bir stratejiyi tanımlamaktı. Sonuçlara olan güveni artırmak ve sadece tek bir töz kullanılmışsa mevcut olmayacak ek bilgiler sunmak için hücre sayısını değerlendirmek için iki ortogonal teknik kullanılmıştır. Tahlillerden biri doğrudan tdTomato-pozitif hücreleri saymak için bir floresan hücre görüntüleyici kullanılan ve ikinci böylece hücre n…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NINDS Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| B-27 (50X) | ThermoFisher Scientific | 17504001 | Neural stem cell medium component. |
| BenchTop pipettor | Sorenson Bioscience | 73990 | Provides ability to pipette compound library into a 96-well plate in one shot. |
| BioLite 96 well multidish | Thermo Scientific | 130188 | Any 96 well cell culture plate will work. We use these in our work. |
| Cell culture microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Visual inspection of cells to ensure proper density. |
| Cytation 5/ Imaging reader | BioTek | CYT3MFV | Used for cell imaging and absorbance readings. |
| DMSO | Fisher Scientific | 610420010 | Solvent for compounds used in screen. Dissolves MTT precipitates to facilitate absorbance measurements. |
| FGF-basic | Peprotech | 100-18B | Neural stem cell medium component. |
| GelTrex | ThermoFisher Scientific | A1413202 | Neural stem cell basement membrane matrix. Allows cells to attach to cell culture plates. |
| Gen5 3.04 | BioTek | Analysis software to determine cell counts for tdTomato expressing cells. | |
| Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | Neural stem cell medium component. |
| Microtest U-Bottom | Becton Dickinson | 3077 | Storage of compound libraries. |
| MTT | ThermoFisher Scientific | M6494 | Active assay reagent to determine cellular viability. |
| Multichannel pippette | Rainin | E8-1200 | Column-by-column addition of cell culture medium, MTT, or DMSO. |
| Neurobasal medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | Neural stem cell base medium. |
| RFP filter cube | BioTek | 1225103 | Filter in Cytation 5 used to image tdTomato expressing cells. |
| TrypLE | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Cell dissociation reagent. |
References
- National Research Council. . Toxicity Testing in the 21st century: A Vision and a Strategy. , (2007).
- Llorens, J., Li, A. A., Ceccatelli, S., Sunol, C. Strategies and tools for preventing neurotoxicity: to Test, to predict, and how to do it. Neurotoxicology. 33 (4), 796-804 (2012).
- Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. Cell proliferation and cytotoxicity assays. Current Pharmaceutical Biotechnology. 17 (14), 1213-1221 (2016).
- Ciofani, G., Danti, S., D’Alessandro, D., Moscato, S., Menciassi, A. Assessing cytotoxicity of boron nitride nanotubes: interference with the MTT assay. Biochemical and Biophysical Research Communications. 394 (2), 405-411 (2010).
- Tennant, J. R. Evaluation of the trypan blue technique for determination of cell viability. Transplantation. 2 (6), 685-694 (1964).
- Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 64 (3), 313-320 (1983).
- Ahmed, S. A., Gogal, R. M., Walsh, J. E. A new rapid and simple nonradioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine incorporation assay. Journal of Immunological Methods. 170 (2), 211-224 (1994).
- Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: Standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).
- Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).
- Malik, N., et al. Compounds with species and cell type specific toxicity identified in a 2000 compound drug screen of neural stem cells and rat mixed cortical neurons. Neurotoxicology. 45, 192-200 (2014).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), 100 (2006).
- Cerbini, T., et al. Transcription activator-like effector nuclease (TALEN)-mediated CLYBL targeting enables enhanced transgene expression and one-step generation of dual reporter human induced pluriopotent stem cell (iPSC) and neural stem cell (NSC) lines. PLoS One. 10 (1), 0116032 (2015).
- Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
- Qie, S., et al. Glutamine depletion and glucose depletion trigger growth inhibition via distinctive gene expression reprogramming. Cell Cycle. 11 (19), 3679-3690 (2012).
- Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells. Scientific Reports. 8 (1), 3029 (2018).
- Carmichael, J., DeGraff, W. G., Gazdar, A. F., Minna, J. D., Mitchell, J. B. Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing. Cancer Research. 47 (4), 936-942 (1987).
- Romijn, J. C., Verkoelen, C. F., Schroeder, F. H. Application of the MTT assay to human prostate cancer cell lines in vitro: establishment of test conditions and assessment of hormone-stimulated growth and drug-induced cytostatic and cytotoxic effects. Prostate. 12 (1), 99-110 (1988).
- Jo, H. Y., et al. The unreliability of MTT assay in the cytotoxic test of primary cultured glioblastoma cells. Experimental Neurobiology. 24 (3), 235-245 (2015).
- Kalinina, M. A., Skvortsov, D. A., Rubtsova, M. P., Komarova, E. S., Dontsova, O. A. Cytotoxicity test based on human cells labeled with fluorescent proteins: photography, and scanning for high-throughput assay. Molecular Imaging and Biology. 20 (3), 368-377 (2018).
