Summary
배양 된 세포에 화합물 세트의 잠재적 인 세포 독성을 평가하는 것이 종종 필요합니다. 여기서, 우리는 96 웰 형식으로 독성 화합물을 안정적으로 선별하는 전략을 설명합니다.
Abstract
세포 독성은 치료 혜택을 가질 수 있는 약물을 공부할 때 정량화 될 필요가 중요 한 매개 변수. 이 때문에, 많은 약물 스크리닝 검사는 개별 화합물에 대해 프로파일화되는 중요한 특성 중 하나로 세포 독성을 이용한다. 배양되는 세포는 더 비싸고 노동 집약적인 동물 모형에 있는 유망한 지도 화합물에 후속을 진행하기 전에 세포 독성을 평가하는 유용한 모형입니다. 우리는 인간 신경 줄기 세포 (NSC) 선을 표현하는 tdTomato에 있는 세포 성장에 영향을 미치는 화합물을 확인하는 전략을 기술합니다. 이 전략은 세포 수를 평가하기 위해 2개의 상보적인 assays를 이용합니다. 1개의 분석제는 3-(4,5-디메틸티졸-2-yl)-2,5-디페닐테틀라졸륨 브로마이드(MTT)의 감소를 통해 세포 수에 대한 프록시로서 포르마잔을 하고 다른 하나는 직접 TdTomato 발현 NSC를 계산한다. 2개의 실험은 단 하나 실험에서 동시에 수행될 수 있고 노동 집약적이고, 급속하고, 저렴하지 않습니다. 이 데모에 설명된 전략은 96웰 플레이트 형식의 독성에 대한 예비 1차 화면에서 57개의 화합물을 테스트했습니다. 3개의 안타는 1차 화면과 동일한 분석 설정을 사용하여 6점 투여 반응에서 더 특징을 보였다. 독성에 대한 우수한 부식을 제공하는 것 외에도, 두 가지 측정법의 결과의 비교는 세포 성장의 다른 양상에 영향을 미치는 화합물을 식별하는 데 효과적일 수 있다.
Introduction
치료 잠재력을 가지고 있는 화학 화합물에 대 한 결정 해야 하는 가장 중요 한 특성 중 하나는 동물 세포에 그것의 독성. 이 특성은 약물이 더 광범위한 연구를위한 좋은 후보인지 여부를 결정합니다. 대부분의 경우, 최소한의 독성을 가진 화합물이 모색되지만 특정 세포 유형을 죽일 수 있는 능력을 가진 화합물이 관심있는 상황이 있습니다, 예를 들어, 항 종양성 약물. 전체 동물이 전신 독성을 결정하는 가장 좋은 모델 시스템이지만, 몇 가지 화합물을 테스트해야 할 때 관련된 비용과 노동력은 엄다합니다. 이와 같은 포유류 세포 배양은 일반적으로 가장 효율적인대안1,2로사용된다. 중소형 처리량 약물 스크린은 세포 배양에서 독성을 평가할 수 있는 중요한 양상입니다. 이러한 화면은 개별 신호 경로를 대상으로 하는 추가라이브러리를 심문하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 스크린의 일반적인 형식은 처음에 예비 1차 독성 화면에서 단일 용량(일반적으로 10 μM)으로 라이브러리의 모든 화합물을 테스트한 다음, 독성을 완전히 특성화하기 위해 심층적인 이차 용량 응답 스크린을 수행하는 것입니다. 기본 화면에서 조회수의 프로필을 볼 수 있습니다. 이 전략을 구현하는 방법은 여기에 설명되어 독성 화합물을 식별하고 특성화하는 빠르고 효율적이며 저렴한 방법을 제공합니다.
포유류 세포에서 작은 화합물 및 나노 물질의 세포 독성을 평가하기 위해 여러 가지 방법이 개발되었습니다3,4. 특정 물질이 잘못된 결과를 제공하는 분석과 상호 작용할 수 있으며, 독성 화면에서 안타를 특성화 할 때 이러한 상호 작용을 테스트해야합니다4. 세포독성 분석법은 트라이판 블루 배제5,락테이트 탈수소효소(LDH) 방출분석분석6,알라마르블루분석7,칼시엔 아세톡시메틸에스테르(AM)8,ATP 분석기9를포함한다. 이 모든 측정은 세포 번호에 대한 프록시 역할을 할 수있는 세포 대사의 다양한 측면을 측정합니다. 모든 혜택을 제공하는 동안, 테트라 졸륨 염계 측정기 3-(4,5-디메틸티졸-2-yl)-2,5-디페닐테테라졸리움 브로마이드(MTT), 2,3-비스(2-메톡시-4-니트로-5-설포페니)-2H-테트라즈리움-1-카르데 및 4-(3-[4- Iodophenyl]-2-[4-니트로페닐]-2H-5-테트라졸리오)-1,3-벤젠 이설포네이트 (WST-1)10,11은 저렴한 비용으로 좋은 정확성과 사용 편의성을 제공합니다. 이 데모에서 사용되는 MTT는 미토콘드리아 환원효소에 의해 불용성 포르마잔으로 감소되고 이 변환의 속도는 세포 수와 강하게 상관관계가 있다. 이 분석은 작은 규모와 최대 2,000 개의 화합물12를가진 선별 라이브러리에 일상적으로 활용되었습니다. 표지된 마커에 의한 세포의 직접 계수는 세포 수를 평가하는 또 다른 방법을 제공하며, MTT 분석과는 달리 세포 성장의 역학에 대한 추가 정보를 제공할 수 있다. 공개적으로 사용할 수 있는 여러 알고리즘은 자동화된 셀 수 분석을 수행할 수 있으며 이미징 판독기13,14를위한 소프트웨어 패키지의 일부인 독점 알고리즘도 있습니다. 이 방법 설명에서, tdTomato15를 구성적으로 발현하기 위해 유전자 편집된 인간 신경 줄기 세포(NSC) 라인은 MTT 분석과 자동화된 세포 계수 사이의 세포 생존 결과를 비교하는 테스트 라인역할을 할 것이다. 57 개의 시험 화합물의 독성을 평가하는 화면에서 분석. 이 전략의 주요 목표는 독성 화합물을 식별하고 특성화하는 것이었지만, 잠재적으로 성장 억제 및 성장 강화 화합물을 식별하는 추가적인 이점을 가지고 있으므로 약물을 식별하는 효과적인 방법을 제공합니다. 즉, 세포 성장을 조절 할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. NSC 문화
참고: 인간 NSC 라인의 조작은 아래에 설명될 것이지만 모든 세포주가 이 프로토콜에 사용될 수 있다. 모든 세포 배양 작업은 생물학적 안전 캐비닛에서 수행됩니다.
- 지하 막 / 세포 외 매트릭스 (ECM)로 96 웰 플레이트를 코팅하십시오.
- 얼음에 NSC의 부착을 용이하게하는 ECM(재료의 테이블)의aliquot를 해동합니다. ECM을 10 mL 염기배지(표)에서적절한 농도(일반적으로 1:100)로 희석하고, 96웰 플레이트의 60개의 내부 웰각각에 웰당 50 μL을 첨가한다(그림1). 가장자리 효과16에서발생할 수 있는 아티팩트를 피하기 위해 내부 60웰만 사용하십시오.
- 플레이트를 실온 또는 세포 배양 인큐베이터(37°C, 5%CO2)에적어도 30분 동안 앉게 한다.
- 해리 및 플레이트 신경 줄기 세포.
참고: 이 방법에서 사용하기 위한 세포는 T75 플라스크에서 적어도 80% 합류로 성장되어야 한다.- 37°C에서 세포 배양 인큐베이터에서 T75 플라스크에서 배양 세포는 기본 배지, B27, 비필수 아미노산, 2 mM 글루타민, 및 10 ng/mL 기본 섬유아세포 성장 인자(FGFb 또는 FGF2)로 구성된 NSC배지에서 5% CO2를 한다.
- 인큐베이터에서 세포를 제거하고 80 % 합류에 도달하면 NSC 배지를 흡인하십시오. 적당량의 세포 해리 시약(T75 플라스크의 경우 3 mL) 첨가; 재료 표) 인큐베이터에서 5분 동안 배양합니다.
- 배양 후, 모든 세포가 분리될 수 있도록 T75 플라스크와 피펫에 NSC 배지 7mL를 적극적으로 첨가합니다. 해리된 세포 용액을 15 mL 튜브 및 원심분리기를 200 x g에서 5분 동안 이송합니다.
- 원심 분리 후, 관에서 상온을 제거하고 NSC 배지 및 카운트 세포의 10 mL에서 세포를 다시 중단.
- NSC 배지로 세포의 농도를 200,000 세포/mL로 재조정합니다. 웰에 균일 한 도금세포를 완전히 재중단되었는지 확인하십시오.
- 플레이트 100 μL은 섹션 1.1에 기재된 바와 같이 코팅된 3개의 96웰 플레이트의 60개의 내부 웰에서 세포 혼합물(20,000 셀)을 한다. 8채널 멀티채널 파이펫터의 8개 슬롯 중 6개 슬롯을 열별로 플레이트 셀에 사용합니다.
- 셀이 없는 모든 웰에 100 μL의 염기 배지 또는 NSC 배지를 추가하여 가장 바깥쪽 우물에서 발생할 수 있는 증발을 최소화합니다.
- 세포 배양 현미경하에서, 세포가 예상 된 밀도에서 시드되는지 확인하기 위해 3 개의 96 웰 플레이트 각각에 적어도 10 개의 우물을 육안으로 검사합니다. 세포가 너무 희소하거나 조밀 한 밀도로 도금된 경우 분석으로 진행하지 마십시오.
2. 화합물로 세포 치료
참고 : 이 데모에서 테스트 된 홈 메이드 라이브러리에는 날개없는 / 통합 (Wnt), 레티노산, 성장 인자 베타 (TGF-β) 및 소닉 고슴도치 신호 경로뿐만 아니라 다양한 티로신 키나아제를 조절하는 화합물이 포함되어 있습니다.
-
독성/세포 수에 대한 예비 1차 화면
- Aliquot 50-100 mL 의 50-100 mL 의 57 테스트 화합물(보충 표 1)100% 디메틸 설폭화물 (DMSO)에 10mMM의 농도로 내부 60 웰의 U 바닥, V 바닥 또는 둥근 바닥 96 웰 플레이트와 3 개의 DMSO 우물을 제어 (참조) 플레이트 맵에 대한 그림 1). 이것은 여러 번 동결 및 해동될 수 있는 화합물의 25 μL을 가진 마스터 화합물 플레이트로서 작용할 것이다.
참고 : 평평한 바닥 판은 벤치 상단 파이프터로 소량의 화합물을 흡인하는 것이 더 어려울 것이기 때문에 사용해서는 안됩니다. - 섹션 1에 기재된 바와 같이 분할후 인큐베이터 16-24시간에서 세포 배양 플레이트를 제거하고 8채널 멀티웰 플롯 중 6개만을 사용하여 8채널 멀티웰 피펫기로 NSC 배지 컬럼바이컬을 흡인한다. 3개의 복제 플레이트 각각에 95 μL의 신선한 NSC 배지를 첨가하고 아래 2.1.4단계가 완료될 때까지 플레이트를 인큐베이터에 다시 놓습니다.
- 8채널 멀티웰 피펫터가 있는 빈 U-bottom, V-바닥 또는 둥근 바닥 96웰 플레이트의 내부 60개 웰각각에 49 μL의 NSC 배지를 추가합니다. 마스터 컴파운드 플레이트를 풀고 벤치 상부 피펫터 또는 동등한 계측기를 사용하여 마스터 플레이트로부터 화합물의 1 μL을 각각의 내부 60웰에서 NSC 배지의 49 μL로 파이펫에 넣습니다.
- 희석된 화합물을 벤치 상단 피펫터와 3x 혼합합니다.
- 인큐베이터에서 3개의 96웰 플레이트를 제거하고, 벤치 탑 피펫으로 각 희석 화합물의 피펫 15 μL을 제거하고 3개의 플레이트 각각에 5 μL의 화합물을 분배한다.
참고: 이 1:20 단계 2.1.3단계에서 초기 1:50 희석과 함께 세포 내로 화합물의 희석은 1:1000 희석을 산출하여 NSC에 화합물의 최종 농도가 0.1%의 DMSO 농도와 최종 10 μM이 되도록 합니다. DMSO 제어에 대한 농도는 0.1%가 됩니다. - 72 시간 동안 화합물로 세포를 배양하고 세포 독성 세포 독성 세포 로 진행합니다. 더 짧은 간격을 사용할 수 있습니다 하지만 72 시간 잠복기 테스트 화합물의 잠재적인 세포 독성 효과 극대화 한다.
- Aliquot 50-100 mL 의 50-100 mL 의 57 테스트 화합물(보충 표 1)100% 디메틸 설폭화물 (DMSO)에 10mMM의 농도로 내부 60 웰의 U 바닥, V 바닥 또는 둥근 바닥 96 웰 플레이트와 3 개의 DMSO 우물을 제어 (참조) 플레이트 맵에 대한 그림 1). 이것은 여러 번 동결 및 해동될 수 있는 화합물의 25 μL을 가진 마스터 화합물 플레이트로서 작용할 것이다.
-
투여량 반응 분석
참고: 투여량 응답에 사용되는 96웰에 대한 설정은 그림 2에 표시되어 있습니다.- 6개의 DMSO 대조군을 위해 컬럼 2를 사용하여 10 μM의 고용량으로 시작하여 6회 투여량에서 2배 직렬 희석에서 최대 3개의 상이한 화합물을 복제하고 시험합니다.
- DMSO 또는 시험 화합물 의 4 μL을 1.5 mL 미세 원심 분리튜브에서 NSC 배지의 196 μL로 희석한다. B2-G2의 우물 열에 25 μL의 DMSO를 추가하고 B3-B11에서 테스트 화합물의 50 μL을 행에 추가하고 10 mM의 세 가지 테스트 화합물을 B3-B5, B6-B8 및 B9-B11행으로 삼중배액으로 추가합니다.
- 96웰 플레이트의 내부 부에 남아 있는 빈 컬럼에 NSC 배지의 피펫 25 μL. 다중 채널 파이펫터로 웰 B3-B11에서 25 μL의 화합물을 제거하고, 웰 C3-C11에 추가하고, 적어도 5번 혼합합니다. 나머지 행에 대 한 프로세스를 반복 2 배 희석에서 삼각계를 생성 하는 각 화합물에 대 한 총 6 개의 복용량에 대 한.
- 섹션 2.1에서 기본 화면에 대해 설명된 대로 투여량 응답에 대한 NSC를 생성한다. 투여량 반응에 대한 화합물은 단계 2.1.5 및 2.1.6에 기재된 바와 같이 세포상에 정확하게 첨가및 배양된다.
참고: 투여량 반응 분석의 3개의 생물학적 복제는 별도의 날에 상이한 구절에서 NSC에 대한 분석검사를 반복함으로써 수행된다.
3. 플레이트 리더의 이미징 셀
- 세포가 할당된 시간 동안 화합물로 배양된 후, 플레이트 리더상에서 이미지 셀은 웰당 전처리 세포 수를 결정한다.
참고 : 이미징 세포에 대한 지침은 독자에 특정하지만 일반적으로 유사한 전략을 따릅니다. 아래 지침은 이데모(재질 표)에사용된 판독기에 적용됩니다. - 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 플레이트 리더 내부에 놓습니다. 이미저 소프트웨어를 열어 스터디용 프로토콜 및 실험 파일을 설정합니다. 작업 관리자에서 이미저 수동 모드로 이동하여 지금 캡처를 클릭합니다....
- 용기 유형으로 96웰 플레이트를 선택하고 배율을 위해 10x를 선택하고, 이미징 tdTomato의 경우 적색 형광 단백질(RFP) 531 및 593을 선택합니다. 웰을 선택한 다음 자동 초점을 클릭하여 이미지에 초점을 맞추고 적절한 노출 시간을 위해 자동 노출을 클릭합니다. 필요한 경우 초점과 노출을 수동으로 조정합니다.
- 적절한 초점과 노출이 완료되면 카메라 아이콘을 클릭하여 사진을 캡처합니다. 그런 다음 이미지 위의 프로세스/ANALZYE를 클릭하여 프로토콜을 계속 빌드하고 분석 탭을 선택합니다.
- 이미지 오른쪽에 있는 분석 추가 단계에서 셀룰러 분석을 클릭하고 시작을 클릭합니다. 각 개별 셀을 나타내기 위해 강조 표시된 셀이 이미지에 표시됩니다. 옵션 선택을 클릭하여 형광 임계값 또는 셀 크기에 따라 더 나은 셀을 선택하도록 매개 변수를 변경할 수 있습니다. 이미저에서 셀을 올바르게 계산하는 경우 화면 하단의 단계 추가를 클릭합니다.
- 화면 상단의 아이콘을 클릭하여 이미지 세트에서 실험 만들기를클릭하여 실험창을 엽니다. 일단 열리면 프로토콜 탭 아래에서 프로시저를 클릭하고 열리는 새 창에서 읽기를선택한 다음 새 창에서 전체 플레이트를 클릭하여 셀을 포함하는 60개의 웰만 선택합니다(B2... G11). 확인을 클릭하여 변경 내용을 저장한 다음 절차 창에서 확인을 클릭합니다.
- 이제 이 프로토콜로 플레이트를 이미지화할 수 있으며 실험 파일을 저장할 수 있습니다. 플레이트를 실행하려면 재생 아이콘을 클릭합니다. 첫 번째 플레이트가 이미지화되면 다른 두 플레이트를 이미지화합니다. 이미징이 완료되면 분석을 위해 셀 카운트 데이터를 스프레드시트에 다운로드합니다. 모든 이미지를 10배 배율로 찍습니다.
4. 말단 MTT 세포 독성 분석
참고 : tdTomato 이미징을 완료 한 후 2 시간 이내에 MTT 분석시험을 시작합니다.
- 25 mg의 MTT를 계량하고 NSC 매체의 5 mL에서 다시 중단하여 5 mg / mL MTT 재고 솔루션을 만드십시오. MTT의 눈에 보이는 침전이 없을 때까지 용액을 소용돌이치며, 이는 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다.
- 인큐베이터로부터 세포 배양 판을 제거하고 세포 배양 배지를 흡인한다. MTT 1:10을 세포 배양 배지에서 희석시키고 각 유정에 MTT 100 μL을 첨가한다.
- 2 시간 동안 37 °C에서 세포를 배양합니다. 보라색 침전제는 우물에있는 세포의 수에 비례하여 대략 적으로 볼 수 있어야합니다. MTT 용액을 플레이트에서 흡인하거나 플레이트를 신속하게 반전하여 플레이트에서 용액을 플릭합니다.
- 각 우물에 50 μL의 100% DMSO를 추가하고 400 rpm에서 10 분 동안 실온에서 접시를 흔들어줍니다. 플레이트 리더에서 595 nm에서 각 웰의 흡광도를 읽고 분석을 위해 스프레드시트로 데이터를 내보냅니다.
5. 데이터 분석
- 적절한 소프트웨어 (상용 스프레드 시트, R)와 tdTomato 세포 수와 흡광도의 분석을 수행합니다. 정상화를 위해 각 플레이트에 복제된 3개의 DMSO 의 흡광도 또는 셀 수에 대한 평균을 계산한 다음 플레이트의 각 웰에 대한 셀 수 또는 흡광도값을 이 평균으로 나누고 백분율로 변환합니다. 이것은 각 플레이트에 대한 DMSO 제어에 비해 정규화된 세포 수 또는 흡광도를 산출한다.
- 세 플레이트의 복제 웰에 대한 평균 정규화 개수 또는 흡광도 및 표준 편차를 계산합니다.
참고: 이 시점에서 정규화된 값의 네 가지 세트가 있어야 합니다: 각 플레이트에 대해 하나, 세 개의 복제 플레이트에 대해 평균 하나. - 세 복제 플레이트에 걸쳐 평균에 대해 25% 이하의 정규화된 값을 사용하여 화합물을 독성으로 분류합니다. 또한, 화합물당 단일 처리만이 각 플레이트에서 수행되므로, 3개의 복제 플레이트 모두에 이 임계값 이하로 떨어지는 화합물만 독성으로 분류됩니다. 이 분석이 독성으로 필터링하여 독성을 시각적으로 확인하는 모든 화합물의 형광 이미지를 검사합니다.
참고: 성장 억제 또는 성장 강화 효과를 가진 화합물의 식별은 각 플레이트에 복제물이 부족하기 때문에 이러한 유형의 예비 분석에서 평가하기가 더 어렵다. 그러나, 다음은 감속 하거나 세포 성장을 향상 시킬 수 있는 화합물을 식별 하는 빠른 방법. - 각 플레이트에서 3개의 복제 된 DMSO 컨트롤에 대한 표준 편차를 계산한 다음 DMSO 컨트롤 위 또는 아래에 평균 값이 두 개 이상 있는 화합물을 필터링합니다. 세 판의 각각에이 필터에서 떨어지는 화합물은 추가 조사를 보증 할 수있다.
- 1차 독성 스크린으로서 투여량 반응에 대해 동일한 분석 전략을 사용한다. 각 생물학적 복제에 대한 DMSO 컨트롤의 평균을 계산하고 이러한 값을 사용하여 각 화합물/투여량 조합에 대한 백분율 라이브 셀 또는 퍼센트 흡광도를 정규화합니다. 세 가지 생물학적 복제에 대한 모든 화합물/투여량 조합에 대한 평균 및 표준 오차를 계산합니다.
- 농도를 로그 값으로 변환하고, 농도 로그 대 정규화된 생존 가능성에 대한 투여량 응답 곡선을 생성하고, 비선형 회귀 분석으로 곡선에 맞춥습니다(분석은 R 또는 다양한 상업적 통계에서 수행될 수 있습니다) 패키지)를 참조하십시오. 치명적인 복용량을 계산 50 (또는 기술적으로이 경우 실행 가능한 복용량 50) 또는 이 곡선의 방정식에서 50% 독성을 초래 하는 화합물의 농도. 많은 소프트웨어 패키지가 자동으로 이 수치를 계산합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
자동화된 셀 카운트 데이터는 DMSO 제어로 정규화될 때 25% 미만의 생존율로 11개의 화합물을 확인했으며 MTT 데이터는 이러한 동일한 화합물과 2개의 추가 화합물을 확인하였다(표1 및 표 2,적색). MTT 분석(wells F3 및 G10)에서만 독성이 있는 것으로 밝혀진 두 화합물은 각각 31%와 39%를 가졌고, 대조군및 계급 순서에 의한 tdTomato 양성 세포의 수는 독성으로 간주된 후 이 라이브러리에서 다음으로 가장 독성이 강한 화합물 2개였다. 이 두 웰의 표준 편차 값은 평균을 왜곡한 세 개의 플레이트 사이에 이상치가 있음을 시사하지 않았으며, 세 개의 복제 플레이트 각각에 대한 숫자를 조사할 때 어느 쪽도 25% 임계값 아래로 떨어졌습니다. (데이터가 표시되지 않음) tdTomato 형광의 대표적인 이미지는 그림 3의여러 우물에서 표시됩니다. MTT와 세포 수 분석 사이의 독성에 대한 불협화음의 두 웰의 이미지의 검사는 F3(그림 3B)와G10(그림 3C)의화합물이 모두 독성이 있었음을 밝혔다. 잘 G10에 몇 잔류 라이브 세포가 있었다 (데이터는 표시되지 않음). 이 경우 MTT 분석은 때때로 이미저의 세포 계산 알고리즘이 실수로 죽은 / 죽어가는 세포를 계산하기 때문에 세포 독성에 대한 점수를 더 잘 할 수 있었던 것으로 보입니다.
MTT 분석은 독성을 결정하기 위해 설계되었지만, 라이브러리가 세포 성장을 향상시키고 억제하는 화합물을 함유할 수 있기 때문에 분석이 잠재적 성장 억제 및 증식 효과를 모두 정량화하는 방법을 평가하는 것이 유익할 것입니다. 테스트 된 화합물. 이를 위해 필터를 사용하여 화합물의 정규화된 평균 흡광도 또는 세포 수가 25% 이상이고 3개의 복제 플레이트각각에 대한 제어 수단 이하의 2개 미만의 표준 편차가 있는 경우 화합물을 성장 억제제로 분류하였다(그늘이 드리워진 플레이트). 표 1과 표 2에서노란색입니다. 11개의 화합물은 세포 수 분석에 의해 유독하다고 이전에 언급한 것들인 데반이 있었지만, 세포 수 분석과 MTT 분석(E10)을 가진 MTT 분석의 기준을 충족시켰고, 두 분석기 사이에 겹치는 두 개의 분석만으로는 MTT 분석(F3)에 의해 독성이 있다고 언급한 화합물이 , G10)을 참조하십시오.
정규화된 수단이 3개의 복제 플레이트 각각에 대한 제어 수단 위의 2개의 표준 편차였던 화합물은 성장 향상으로 분류되었다(표 1 및 표 2에서그늘진 녹색). 단지 하나의 화합물은 각 분석및 화합물이 분석사이 중첩되지 않았다는 기준에 적합합니다. MTT와 세포 수 분석 사이의 불일치를 가진 우물의 추가 검사는 MTT가 tdTomato 분석에 비해 세포 수를 과대 평가하는 일부 예의 우물에서 세포가 더 큰 것으로 나타났다는 것을 나타냈습니다(그림 3C) , MTT가 tdTomato에 비해 세포 수를 과소 평가한 그 우물은 세포가 더 작은 것으로 나타났다(그림 3D). 요약하면, tdTomato 분석은 11개의 화합물을 독성으로 분류하고, 11개는 성장 억제증으로, 1개는 세포 성장에 명백한 영향을 미치지 않는 34로 성장 을 강화하였다(표1). MTT 분석은 13개의 화합물을 독성으로 분류하였고, 2개는 성장 억제제로서, 1개는 세포 성장에 명백한 영향을 미치지 않는 41개의 성장으로 강화되었다(표2).
6점 용량 반응 분석기는 독성으로 확인된 화합물 3개에 대해 수행되었다. 이들 3가지 화합물은 STAT3 억제제 WP1066(B5) 및 통계(E4) 및 표피 성장인자 수용체 억제제 티르호신 9(E11)이었다. 투여량은 최대 농도 10 μM에서 시작하여 312.5 nM의 최소 농도로 가는 연속적인 2배 희석이었다. 이들 화합물 중 하나(WP1066)에 대한 세포 수 및 MTT 측정결과 모두에 대한 생존 세포의 농도 대 정규화 비율의 로그의 그래프는 도 4에나타내고 있다. 곡선은 4 개의 가장 낮은 농도에 대한 독성이없는 상대적으로 평평하고 5 μM 투여량에서 빠르게 떨어지고 10 μM에서 거의 완전한 독성으로 떨어집니다. 치사용량 50(LD50)은tdTomato 분석법 및 MTT 분석에 대한 6.0 μM에 대해 4.4 μM으로 계산하였다. 다른 두 화합물에 대한 tdTomato 및 MTT LD50 값은 각각 3.4 μM 및 4.7 μM, 정적, 및 0.8 μM 및 1.6 μM, 트립호신 9에 대해 각각 이었다.
그림 1 : 1차 독성 스크린에 사용되는 마스터 컴파운드 플레이트용 플레이트 맵. 모든 외부 웰은 회색으로 음영되어 셀이 없는 매체가 포함되어 있음을 나타냅니다. DMSO 제어 (100%) 우물 B2, D6 및 G11에 굵게 표시됩니다. Cmpd로 표시된 모든 웰은 100% DMSO에서 10 mM 농도에서 독특한 시험 화합물을 함유하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 투여량 반응 분석에 사용되는 화합물 플레이트용 플레이트 맵. 모든 외부 웰은 회색으로 음영되어 셀이 없는 미디어만 포함되어 있음을 나타냅니다. DMSO 컨트롤은 열 2에 보관되었습니다. 모든 화합물/투여 량 조합의 삼중체가 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : tdTomato 형광 이미지 선택한 우물 72 시간 후 처리. (A)음 B2 : DMSO 제어,(B)잘 F3 : 세포 수 데이터는 독성을 제안하지만 MTT 데이터는 하지 않았다,(C)잘 E6 : tdTomato 수에 상대 MTT에 의해 과대 평가 된 세포 수,(D)MTT에 비해 잘 G6 과소 평가 세포 수에 비해 tdTomato. 모든 이미지는 여기/방출을 위해 531/593 nm 파장이 있는 RFP 필터를 사용하여 10배 배율로 촬영되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 웰 B5의 화합물에 대한 로그 농도 대 생존률 % DMSO에 대한 곡선. 곡선의 포인트는 3개의 생물학적 복제에 대한 평균의 6회 투여±표준 오차에서 평균 정규화된 생존 세포를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 3개의 복제 플레이트에 대한 백분율 DMSO 제어로 정규화된 tdTomato 셀 카운트 의 수단 ± 표준 편차. 잘 차이다음을 나타냅니다 : 빨간색, 독성 화합물; 노란색, 잠재적으로 성장 억제; 녹색, 잠재적으로 성장 향상. 어떤 샤딩은 화합물이 세포 성장에 영향을 미치지 않았음을 나타냅니다.
표 2: 3개의 복제 플레이트에 대한 백분율 DMSO 제어로 정규화된 MTT 흡광도 수단 ± 표준 편차. 잘 차이다음을 나타냅니다 : 빨간색, 독성 화합물; 노란색, 잠재적으로 성장 억제; 녹색, 잠재적으로 성장 향상. 어떤 샤딩은 화합물이 세포 성장에 영향을 미치지 않았음을 나타냅니다.
| 잘 | 화합물 | 노트 |
| B2 | Dmso | 네거티브 컨트롤 |
| C2 | 캠프 | 단백질 키나제 A 활성제 |
| D2 | 프랙토틴 | 케모키네 |
| E2 | LDN212854 | 뼈 형태 유전학 단백질 (BMP) 수용체 억제제 |
| F2 | AG370 | 혈소판 유래 성장 인자 수용체 (PDGFR) 키나아제 억제제 |
| G2 | DAPT | 감마-분비효소 억제제; 신경 분화 양성 대조군 |
| B3 | AY9944 | 7-하이드로콜레스트롤 환원효소 억제제; 고슴도치 통로 억제제 |
| C3 | STA-21 | 전사 3(STAT3) 억제제의 신호 변환기 및 활성제 |
| D3 | GM-CSF | 과립세포-대식세포-콜로니-자극 인자; 사이토 카인 |
| E3 | TNP470 | 메티오닌 아미니펩티다제-2 억제제 |
| F3 | 바이오 | 글리코겐 신타제 키나아제-3 억제제; WNT 통로 활성제 |
| G3 | CNTF | 섬모 신경 영양 인자; 뉴로펩타이드 |
| B4 | 산 | 부드럽게 수용 체 길 항 제; 고슴도치 통로 억제제 |
| C4 | AG825 | ERBB2 억제제 |
| D4 | M-CSF | 대식세포 콜로니-자극 인자; 사이토 카인 |
| E4 | 스테이트틱 (주) | 전사 3(STAT3) 억제제의 신호 변환기 및 활성제 |
| F4 | SC79 | AKT (단백질 키나제 B) 활성제 |
| G4 | DMH1 | 뼈 형태 유전학 단백질 (BMP) 수용체 억제제 |
| B5 | WP1066 | 전사 3(STAT3) 억제제의 신호 변환기 및 활성제 |
| C5 | 인슐린 | |
| D5 | IL-3 | 인터류핀-3; 사이토 카인 |
| E5 | AG494 | 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 억제제 |
| F5 | LY294002 | 인스포이노소타이드 3-키나아제 억제제 |
| G5 | IGF2 | 인슐린 성장 인자-2 |
| B6 | Sag | 부드럽게 주작동근; 고슴도치 통로 활성제 |
| C6 | AG370 | 혈소판 유래 성장 인자 수용체 키나아제 억제제 |
| D6 | Dmso | 네거티브 컨트롤 |
| E6 | EC23 | 레티노산 수용체 작용제 |
| F6 | 토린2 | 라파마이신 (MTOR) 억제제의 기계론적 표적 |
| G6 | Y27362 | 단백질 키나아제(ROCK) 억제제가 함유된 로-관련 코일 코일 코일 코일 |
| B7 | 셀레콕스시브 | 사이클로옥시게나아제-2 (COX-2) 억제제 |
| C7 | SB525334 | 성장 인자 베타 수용 체 를 변형 (TGBFR) 억제제 |
| D7 | DAPT | 감마-분비효소 억제제; 신경 분화 양성 대조군 |
| E7 | CHIR99021 | 글리코겐 신타제 키나아제-3 억제제; WNT 통로 활성제 |
| F7 | LDN 193189 | 뼈 형태 유전학 단백질 (BMP) 수용체 억제제 |
| G7 | 타라조틴 주 | 레티노산 수용체 작용제 |
| B8 | AM580 | 레티노산 수용체 작용제 |
| C8 | DHBP | 칼슘 방출 억제제 |
| D8 | JSK | 산화 질소 기증자 |
| E8 | 도르소모르핀 | 골 형태유전학적 단백질(BMP) 수용체 억제제; 5' 아데노신 모노포스테아제 활성화 단백질 키나아제(AMPK) 억제제 |
| F8 | Imatinib | 티로신 키나아제 억제제 |
| G8 | BMS 493 | 역 레티노산 수용체 작용제 |
| B9 | 사이클로파민 | 부드럽게 수용 체 길 항 제; 고슴도치 통로 억제제 |
| C9 | 세마가세스타트 | 감마 분비 효소 억제제 |
| D9 | 보수티니브 주 | 티로신 키나아제 억제제 |
| E9 | 푸르모파민 | 부드럽게 주작동근; 고슴도치 통로 활성제 |
| F9 | 재규어 | 들쭉날쭉한; 노치 수용체 작용제 |
| G9 | SB431542 | 성장 인자 베타 수용 체 를 변형 (TGBFR) 억제제 |
| B10 | SC79 | AKT (단백질 키나제 B) 활성제 |
| C10 | 단트롤린 | Ryanodine 수용 체 길 항 |
| D10 | 티프호신46 | 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 억제제 |
| E10 | AM80 | 레티노산 수용체 작용제 |
| F10 | IFN-Y | 인터페론 감마; 사이토 카인 |
| G10 | PQ401 | 인슐린 같은 성장 인자 수용 체 (IGF1R) 억제제 |
| B11 | DAPT | 감마-분비효소 억제제; 신경 분화 양성 대조군 |
| C11 | A2M | 세포외 당단백질; 프로테아제 억제제 |
| D11 | AG490 | 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 억제제 |
| E11 | 티프호신9 | 혈소판 유래 성장 인자 수용체 (PDGFR) 키나아제 억제제 |
| F11 | BMP-2 | 뼈 형태 유전학 단백질-2 |
| G11 | Dmso | 네거티브 컨트롤 |
보충 표 1: 기본 화면 화합물 목록입니다. 기본 화면에서 사용된 각 화합물에 대한 위치, 이름 및 메모가 제공됩니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 문서의 주요 목표는 낮은-중간 처리량 스크리닝에서 세포 성장에 영향을 미치는 화합물을 효율적이고 저렴하게 식별할 수 있는 전략을 설명하는 것이었습니다. 2개의 직교 기술은 결론에 있는 신뢰를 증가하고 단 하나 분석분석만 사용된 경우에 유효하지 않을 추가 통찰력을 제안하기 위하여 세포 수를 평가하기 위하여 이용되었습니다. 상기 한 가지 는 형광 세포 이미저를 사용하여 tdTomato 양성 세포를 직접 카운트하고 두 번째는 MTT를 포르마잔으로 갈라서 세포 번호10의프록시역할을 하는 미토콘드리아의 잘 특성화된 능력에 의존하였다. 분석의 MTT 날개가 2,000 화합물14만큼라이브러리를 테스트하는 데 사용되었지만 총 57 개의 시험 화합물이 이 데모에서 평가되었습니다. 스크린의 결과는 두 개의 계산서가 더 자신있게 특정 결론에 도달하기에서 서로를 강화할 수 있는 방법을 지적하고, 두 개의 계산제가 일반적으로 추가 정보를 제공하는 상호 보완적인 시나리오를 강조했습니다 두 개 이상의 개별 실험을 수행해야 합니다.
프로토콜에서 가장 중요한 단계는 세포를 도금하기 직전에 발생합니다. 세포 배양에서의 대사 조건은 매우 휘발성이 될 수 있으며, 특히 글루타민과 포도당 소비의 경우, 세포가 너무 높은밀도17,18에서파종되는 경우. 이러한 조건 하에서 세포 사멸은 세포 배양 조건에 내재된 요인과 시험된 화합물의 독성과 관련이 없는 요인에 기인할 것이다. 결과는 세포독성 화합물에 대한 거짓 양성의 증가뿐만 아니라 결과를 재생의 어려움이 될 것이다18. 이 단계에서의 성공은 사용되는 세포주의 적절한 세포 밀도, 도금 전에 셀 수의 정확한 측정, 96의 우물 안팎에서 균일한 도금 분포를 보장하기 위해 세포의 완전한 재현탁액을 아는 것이 필요합니다. - 잘 접시. 또한 현미경으로 도금한 후 세포가 대략 정확한 밀도 2-3시간 으로 존재하는지 시각적으로 확인하는 것이 중요합니다.
분석 자체까지, MTT 분석에 대한 가장 중요한 단계는 MTT가 세포 배양 배지에서 완전히 용해되도록 하는 것입니다. MTT의 잔류 침전물은 그 자체로 급성 세포 독성을 초래할 수 있으므로 MTT를 활발한 소용돌이로 완전히 용해시키는 것이 중요합니다. 세포 카운팅 분석의 가장 중요한 점은 tdTomato 이미징에 대한 정확한 노출 시간을 설정하는 것입니다. 노출 시간이 너무 짧으면 소프트웨어에 의해 계산되지 않는 진정한 형광 세포가 발생할 수 있으며, 너무 긴 노출 시간은 신호가 너무 강해서 소프트웨어가 여러 셀을 하나의 셀로 계산할 수 있도록 이웃 세포를 함께 혼합할 수 있습니다. 그것은 그들14를해결할 수 없기 때문에 . 이미징 판독기와 함께 제공되는 대부분의 소프트웨어 패키지는 계산되는 셀을 보여주는 미리 보기 단계를 허용합니다. 이 미리 보기 단계를 여러 노출 시간에 실행하고 형광 세포를 가장 정확하게 식별하는 단계를 선택하는 것이 중요합니다.
어떤 방법과 마찬가지로 이러한 방법에는 특정 제한이 있습니다. 더 높은 처리량을 얻기 위하여는, 1 차적인 독성 분석은 더 많은 거짓 긍정 및 거짓 부정의 비용으로 올 수 있는 단 하나 처리/단 하나 복용량 패러다임을 사용합니다. 또한, 몇몇 이전 연구 결과는 MTT가 콜로니 형성분석19 또는 티미딘 혼입 분석20를사용할 때 세포 수와 아주 잘 상관관계가 있다는 것을 보여주었더라도, 특정 화합물을 가진 처리는 강화하거나 MTT 분석의 결과가 더 이상 세포 번호21과상관관계가 없는 방식으로 미토콘드리아 활성을 억제한다. 이 데모의 결과는 MTT가 독성 화합물을 식별하는 데 탁월하지만, 이러한 화합물이 미토콘드리아 활성을 변화시키기 때문에 증식을 억제하거나 향상시키는 화합물을 식별하는 능력이 제한적이라는 것을 나타냅니다. 셀 번호와 상관 관계가 덜 하다. tdTomato 계산 분석에도 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 명백한 한계는 형광 단백질을 안정적으로 발현하는 세포주가 필요하다는 것이다. 게놈 조작에 있는 최근 어드밴스는 그 같은 선을 개발하는 것을 훨씬 쉽게 했습니다 그러나 그(것)들을 생성하는 데 필요한 일은 몇몇 실험실의 기능을 넘어있을 지도 모릅니다. 기술적 관점에서 볼 때, 이미지 분석을 사용하는 세포 카운팅 분석의 가장 큰 문제점은 이러한 분석의 무능력으로 인해 함께 군집된 세포를 구별할 수 없기 때문에14개소자 수가 발생하므로 적절한 도금이 정확한 결과를 위해 매우 중요합니다. 또 다른 잠재적인 문제는 밝게 형광 죽은 또는 죽어가는 세포의 계산입니다. 이 문제를 방지 하는 한 가지 방법은 이러한 배경 세포를 제거 하기 위해 계산 하기 전에 PBS로 세포를 세척 하는 것입니다. 이것은 살아있는 세포가 세척시 분리할 수 있기 때문에 특정 덜 잘 부착된 세포 라인을 위해 편리하지 않을 수 있습니다. 이 문제에 대한 대안은 많은 분석 프로그램에 내재된 유연성을 활용하여 좁은 범위 내에서 세포 식별을 위한 파라미터를 사용자 정의하여 살아있는 형광 세포만 계산되도록 하는 것입니다.
이 문서에서 설명하는 전략은 수백 개의 화합물을 효율적으로 스크리볼 수 있는 강력한 방법을 제공합니다. MTT 분석 판독은 미토콘드리아 활성의 생리학적 결과이며 부정확한 결과를 생성할 수 있는 세포주 또는 화합물 특이적 효과를 가질 수 있다4,21. 형광 리포터를 사용하여 세포 계수 분석과 결합함으로써 이러한 한계를 크게 완화할 수 있습니다. 도시된 바와 같이, 두 측정법의 결과를 비교하면 독성 화합물을 식별하는 데 100% 가까이 정확도가 발생할 수 있습니다. 이전 연구는 TDTomato를 안정적으로 발현하는 HEK293T 라인에서 독성 화합물라이브러리(22)에대한 MTT와 tdTomato 간의 높은 IC50 상관관계가 있음을 보여주었다. 이 연구는 유사한 일치 분석을 수행하기에 충분한 히트 화합물에 대한 이차 확인을 실행하지 않았지만, 테스트된 3개의 화합물에 대한 계산된 LD50 값은 유사했다.
독성에 대 한 결론을 강화 하는 그들의 능력 이외에, 두 실험 테스트 화합물의 잠재적인 성장 억제 및 증식 효과 해결 하는 경우 서로 보완할 수 있습니다. 몇몇 시험 화합물을 위해 2개의 분석실험 사이 데이터는 실질적으로 발산했습니다. tdTomato 형광의 이미지를 검사 할 때 이러한 화합물 중 일부에 대한, 치료와 제어 사이의 눈에 띄는 형태 변화가 있었다. 이것은 2개의 검사결과 사이 정규화한 값에 있는 발산이 MTT 판독값 및 tdTomato 세포 수에 분별적으로 영향을 미치는 생리적인 변경에 근거할 수 있다는 것을 건의합니다. 단일 실험으로 이러한 데이터를 수집할 수 있는 능력은 이 전략의 견고성을 크게 높여 더 일반적으로 적용할 수 있도록 합니다. 이와 같이, 그것은 높은 정확도로 독성 화합물을 식별 하지만 더 광범위 하 게 특성화 될 수 있는 세포 성장/생리학에 더 미묘한 효과 가진 화합물을 지적 하는 능력.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 NINDS 교내 연구 프로그램에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-27 (50X) | ThermoFisher Scientific | 17504001 | Neural stem cell medium component. |
| BenchTop pipettor | Sorenson Bioscience | 73990 | Provides ability to pipette compound library into a 96-well plate in one shot. |
| BioLite 96 well multidish | Thermo Scientific | 130188 | Any 96 well cell culture plate will work. We use these in our work. |
| Cell culture microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Visual inspection of cells to ensure proper density. |
| Cytation 5/ Imaging reader | BioTek | CYT3MFV | Used for cell imaging and absorbance readings. |
| DMSO | Fisher Scientific | 610420010 | Solvent for compounds used in screen. Dissolves MTT precipitates to facilitate absorbance measurements. |
| FGF-basic | Peprotech | 100-18B | Neural stem cell medium component. |
| GelTrex | ThermoFisher Scientific | A1413202 | Neural stem cell basement membrane matrix. Allows cells to attach to cell culture plates. |
| Gen5 3.04 | BioTek | Analysis software to determine cell counts for tdTomato expressing cells. | |
| Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | Neural stem cell medium component. |
| Microtest U-Bottom | Becton Dickinson | 3077 | Storage of compound libraries. |
| MTT | ThermoFisher Scientific | M6494 | Active assay reagent to determine cellular viability. |
| Multichannel pippette | Rainin | E8-1200 | Column-by-column addition of cell culture medium, MTT, or DMSO. |
| Neurobasal medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | Neural stem cell base medium. |
| RFP filter cube | BioTek | 1225103 | Filter in Cytation 5 used to image tdTomato expressing cells. |
| TrypLE | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Cell dissociation reagent. |
References
- National Research Council. Toxicity Testing in the 21st century: A Vision and a Strategy. , National Academies Press. Washington DC. (2007).
- Llorens, J., Li, A. A., Ceccatelli, S., Sunol, C. Strategies and tools for preventing neurotoxicity: to Test, to predict, and how to do it. Neurotoxicology. 33 (4), 796-804 (2012).
- Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. Cell proliferation and cytotoxicity assays. Current Pharmaceutical Biotechnology. 17 (14), 1213-1221 (2016).
- Ciofani, G., Danti, S., D'Alessandro, D., Moscato, S., Menciassi, A. Assessing cytotoxicity of boron nitride nanotubes: interference with the MTT assay. Biochemical and Biophysical Research Communications. 394 (2), 405-411 (2010).
- Tennant, J. R. Evaluation of the trypan blue technique for determination of cell viability. Transplantation. 2 (6), 685-694 (1964).
- Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 64 (3), 313-320 (1983).
- Ahmed, S. A., Gogal, R. M., Walsh, J. E. A new rapid and simple nonradioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine incorporation assay. Journal of Immunological Methods. 170 (2), 211-224 (1994).
- Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: Standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).
- Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).
- Malik, N., et al. Compounds with species and cell type specific toxicity identified in a 2000 compound drug screen of neural stem cells and rat mixed cortical neurons. Neurotoxicology. 45, 192-200 (2014).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), 100 (2006).
- Cerbini, T., et al. Transcription activator-like effector nuclease (TALEN)-mediated CLYBL targeting enables enhanced transgene expression and one-step generation of dual reporter human induced pluriopotent stem cell (iPSC) and neural stem cell (NSC) lines. PLoS One. 10 (1), 0116032 (2015).
- Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
- Qie, S., et al. Glutamine depletion and glucose depletion trigger growth inhibition via distinctive gene expression reprogramming. Cell Cycle. 11 (19), 3679-3690 (2012).
- Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells. Scientific Reports. 8 (1), 3029 (2018).
- Carmichael, J., DeGraff, W. G., Gazdar, A. F., Minna, J. D., Mitchell, J. B. Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing. Cancer Research. 47 (4), 936-942 (1987).
- Romijn, J. C., Verkoelen, C. F., Schroeder, F. H. Application of the MTT assay to human prostate cancer cell lines in vitro: establishment of test conditions and assessment of hormone-stimulated growth and drug-induced cytostatic and cytotoxic effects. Prostate. 12 (1), 99-110 (1988).
- Jo, H. Y., et al. The unreliability of MTT assay in the cytotoxic test of primary cultured glioblastoma cells. Experimental Neurobiology. 24 (3), 235-245 (2015).
- Kalinina, M. A., Skvortsov, D. A., Rubtsova, M. P., Komarova, E. S., Dontsova, O. A. Cytotoxicity test based on human cells labeled with fluorescent proteins: photography, and scanning for high-throughput assay. Molecular Imaging and Biology. 20 (3), 368-377 (2018).
