En strategi for å identifisere forbindelser som påvirker Cell vekst og overlevelse i kultivert pattedyrceller ved lav-til-moderat gjennomstrømming
Summary
Det er ofte nødvendig å vurdere den potensielle cytotoksisitet av et sett med forbindelser på kulturperler celler. Her beskriver vi en strategi for pålitelig skjerm for giftige forbindelser i et 96-brønn format.
Abstract
Cytotoksisitet er en kritisk parameter som må kvantifisert når man studerer medikamenter som kan ha terapeutiske fordeler. På grunn av dette, mange narkotika screening analyser utnytte cytotoksisitet som en av de kritiske egenskaper for å bli profilert for individuelle forbindelser. Celler i kultur er en nyttig modell for å vurdere cytotoksisitet før du fortsetter å følge opp lovende bly forbindelser i mer kostbare og arbeidsintensive dyremodeller. Vi beskriver en strategi for å identifisere forbindelser som påvirker cellevekst i en tdTomato uttrykker menneskelige nevrale stamceller (NSC) linje. Strategien bruker to komplementære analyser for å vurdere celle nummer. En analysen fungerer via reduksjon av 3-(4, 5-dimethylthizol-2-YL)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) til formazan som en proxy for celle nummer og den andre direkte teller tdTomato uttrykker NSCs. De to analysene kan utføres samtidig i et enkelt eksperiment, og er ikke arbeidsintensive, raske og rimelige. Strategien beskrevet i denne demonstrasjonen testet 57 forbindelser i en undersøkende primærskjerm for toksisitet i en 96-brønn plateformat. Tre av treffene ble preget videre i en seks-punkts dose respons ved hjelp av samme analysen satt opp som den primære skjermen. I tillegg til å gi utmerket bekreftelse for toksisitet, kan sammenligning av resultater fra de to analysene være effektive i å identifisere forbindelser som påvirker andre aspekter av cellevekst.
Introduction
En av de viktigste egenskapene som må fastsettes for en kjemisk forbindelse som har terapeutisk potensial er dens toksisitet for dyreceller. Dette karakteristiske vil avgjøre om et medikament er en god kandidat for mer omfattende studier. I de fleste tilfeller er forbindelser med minimal toksisitet søkt, men det finnes situasjoner der en forbindelse med kapasitet til å drepe bestemte celletyper er av interesse, for eksempel, anti-tumorigene narkotika. Selv om hele dyr er den beste modellen systemer for å fastslå systemisk toksisitet, er kostnaden og arbeidskraft involvert uoverkommelige når mer enn noen få forbindelser må testes. Som sådan er pattedyr cellekultur vanligvis brukt som den mest effektive alternativ1,2. Små til middels gjennomstrømning narkotika skjermer er en viktig modalitet som toksisitet kan vurderes i cellekultur. Disse skjermene kan brukes til å forhøre kommenterte biblioteker rettet mot individuelle signal veier. Den generelle formatet på en slik skjerm er å først teste alle forbindelsene i biblioteket på en enkelt dose (vanligvis 10 μM) i en undersøkende primær toksisitet skjermen, og deretter utføre en grundig sekundær dose respons skjermen for fullt karakterisere toksisitet profilen til treff fra hovedskjermen. Metodene for å implementere denne strategien vil bli beskrevet her og gi en rask, effektiv og rimelig måte å identifisere og karakterisere giftige forbindelser.
Flere metoder er utviklet for å vurdere cytotoksisitet av små forbindelser og nanomaterialebasert i pattedyrceller3,4. Det bør bemerkes at visse materialer kan samhandle med analysen gir villedende resultater, og slike interaksjoner bør testes når karakteriserer treff fra toksisitet skjermer4. Cytotoksisitet analyser inkluderer trypan Blue eksklusjon5, melkesyre DEHYDROGENASE (LDH) Release analysen6, Alamar blå analysen7, calcien acetoxymethyl Ester (am)8, og ATP-analysen9. Alle disse analysene måle ulike aspekter av celle metabolisme som kan tjene som en proxy for celle nummer. Mens alle tilbyr fordeler, tetrazolium salt-baserte analyser som 3-(4, 5-dimethylthizol-2-YL)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), 2, 3-BIS (2-metoksy-4-Nitro-5-sulfopheny)-2H-tetrazolium-5-carboxyanilide indre salt (XTT)-1 og 4-(3-[4- Iodophenyl]-2-[4-nitrophenyl]-2H-5-tetrazolio)-1, 3-benzen disulfonate (WST-1)10,11 gir god nøyaktighet og brukervennlighet til lave kostnader. MTT, som vil bli brukt i denne demonstrasjonen, er redusert til et uløselig formazan av en mitokondrie reduktase og frekvensen av denne konverteringen samsvarer sterkt med celle nummer. Denne analysen har vært rutinemessig utnyttet både i liten skala og for screening biblioteker med opptil 2 000 forbindelser12. Direkte telling av celler med en merket markør tilbyr en annen metode for å vurdere mobilnummeret, og i motsetning til MTT-analysen kan det gi ytterligere informasjon om dynamikken i mobilnettet vekst. Flere offentlig tilgjengelige algoritmer er tilgjengelige for å utføre automatiserte celle tellings analyser, og det finnes også proprietære algoritmer som er en del av programvarepakker for Imaging leserne13,14. I denne metoden beskrivelse, en menneskelig neural Stem Cell (NSC) linje som har blitt genetisk redigert til constitutively uttrykke tdTomato15 vil tjene som en test linje for å sammenligne cellulære levedyktighet resultater mellom en MTT-analysen og en automatisert celle telling analysen i en skjerm vurdere toksisitet av 57 test forbindelser. Selv om det primære målet med denne strategien var å identifisere og karakterisere giftige forbindelser, har den ekstra fordelen av potensielt identifisere veksthemmende og vekst styrke forbindelser og dermed gir en effektiv metode for å identifisere legemidler som kan modulere mobilnettet vekst.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det primære målet med denne artikkelen var å beskrive en strategi som kan effektivt og rimelig identifisere forbindelser som påvirker cellevekst i en lav-til moderat gjennomstrømming screening. To ortogonale teknikker ble benyttet for å vurdere celle nummer for å øke tilliten til konklusjonene og tilby ytterligere innsikt som ikke ville være tilgjengelig hvis bare en enkelt analysen ble brukt. En av analysene brukt en fluorescerende celle imager å direkte telle tdTomato-positive celler og den andre var avhengig…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av NINDS intramural Research program.
Materials
| B-27 (50X) | ThermoFisher Scientific | 17504001 | Neural stem cell medium component. |
| BenchTop pipettor | Sorenson Bioscience | 73990 | Provides ability to pipette compound library into a 96-well plate in one shot. |
| BioLite 96 well multidish | Thermo Scientific | 130188 | Any 96 well cell culture plate will work. We use these in our work. |
| Cell culture microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Visual inspection of cells to ensure proper density. |
| Cytation 5/ Imaging reader | BioTek | CYT3MFV | Used for cell imaging and absorbance readings. |
| DMSO | Fisher Scientific | 610420010 | Solvent for compounds used in screen. Dissolves MTT precipitates to facilitate absorbance measurements. |
| FGF-basic | Peprotech | 100-18B | Neural stem cell medium component. |
| GelTrex | ThermoFisher Scientific | A1413202 | Neural stem cell basement membrane matrix. Allows cells to attach to cell culture plates. |
| Gen5 3.04 | BioTek | Analysis software to determine cell counts for tdTomato expressing cells. | |
| Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | Neural stem cell medium component. |
| Microtest U-Bottom | Becton Dickinson | 3077 | Storage of compound libraries. |
| MTT | ThermoFisher Scientific | M6494 | Active assay reagent to determine cellular viability. |
| Multichannel pippette | Rainin | E8-1200 | Column-by-column addition of cell culture medium, MTT, or DMSO. |
| Neurobasal medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | Neural stem cell base medium. |
| RFP filter cube | BioTek | 1225103 | Filter in Cytation 5 used to image tdTomato expressing cells. |
| TrypLE | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Cell dissociation reagent. |
References
- National Research Council. . Toxicity Testing in the 21st century: A Vision and a Strategy. , (2007).
- Llorens, J., Li, A. A., Ceccatelli, S., Sunol, C. Strategies and tools for preventing neurotoxicity: to Test, to predict, and how to do it. Neurotoxicology. 33 (4), 796-804 (2012).
- Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. Cell proliferation and cytotoxicity assays. Current Pharmaceutical Biotechnology. 17 (14), 1213-1221 (2016).
- Ciofani, G., Danti, S., D’Alessandro, D., Moscato, S., Menciassi, A. Assessing cytotoxicity of boron nitride nanotubes: interference with the MTT assay. Biochemical and Biophysical Research Communications. 394 (2), 405-411 (2010).
- Tennant, J. R. Evaluation of the trypan blue technique for determination of cell viability. Transplantation. 2 (6), 685-694 (1964).
- Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 64 (3), 313-320 (1983).
- Ahmed, S. A., Gogal, R. M., Walsh, J. E. A new rapid and simple nonradioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine incorporation assay. Journal of Immunological Methods. 170 (2), 211-224 (1994).
- Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: Standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).
- Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).
- Malik, N., et al. Compounds with species and cell type specific toxicity identified in a 2000 compound drug screen of neural stem cells and rat mixed cortical neurons. Neurotoxicology. 45, 192-200 (2014).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), 100 (2006).
- Cerbini, T., et al. Transcription activator-like effector nuclease (TALEN)-mediated CLYBL targeting enables enhanced transgene expression and one-step generation of dual reporter human induced pluriopotent stem cell (iPSC) and neural stem cell (NSC) lines. PLoS One. 10 (1), 0116032 (2015).
- Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
- Qie, S., et al. Glutamine depletion and glucose depletion trigger growth inhibition via distinctive gene expression reprogramming. Cell Cycle. 11 (19), 3679-3690 (2012).
- Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells. Scientific Reports. 8 (1), 3029 (2018).
- Carmichael, J., DeGraff, W. G., Gazdar, A. F., Minna, J. D., Mitchell, J. B. Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing. Cancer Research. 47 (4), 936-942 (1987).
- Romijn, J. C., Verkoelen, C. F., Schroeder, F. H. Application of the MTT assay to human prostate cancer cell lines in vitro: establishment of test conditions and assessment of hormone-stimulated growth and drug-induced cytostatic and cytotoxic effects. Prostate. 12 (1), 99-110 (1988).
- Jo, H. Y., et al. The unreliability of MTT assay in the cytotoxic test of primary cultured glioblastoma cells. Experimental Neurobiology. 24 (3), 235-245 (2015).
- Kalinina, M. A., Skvortsov, D. A., Rubtsova, M. P., Komarova, E. S., Dontsova, O. A. Cytotoxicity test based on human cells labeled with fluorescent proteins: photography, and scanning for high-throughput assay. Molecular Imaging and Biology. 20 (3), 368-377 (2018).
