Una estrategia para identificar compuestos que afectan el crecimiento celular y la supervivencia en células de mamíferos cultivadas a un rendimiento bajo a moderado
Summary
A menudo es necesario evaluar la citotoxicidad potencial de un conjunto de compuestos en las células cultivadas. Aquí, describimos una estrategia para detectar compuestos tóxicos de forma fiable en un formato de 96 pozos.
Abstract
La citotoxicidad es un parámetro crítico que debe cuantificarse al estudiar fármacos que pueden tener beneficios terapéuticos. Debido a esto, muchos ensayos de detección de drogas utilizan citotoxicidad como una de las características críticas a perfilar para compuestos individuales. Las células en cultivo son un modelo útil para evaluar la citotoxicidad antes de proceder a dar seguimiento a compuestos de plomo prometedores en modelos animales más costosos e intensivos en mano de obra. Describimos una estrategia para identificar compuestos que afectan el crecimiento celular en una línea de células madre neuronales humanas (NSC) que expresan tdTomato. La estrategia utiliza dos ensayos complementarios para evaluar el número de celdas. Un ensayo funciona a través de la reducción de 3-(4,5-dimethylthizol-2-yl)-2,5-dphenyltetrazolium bromide (MTT) al formazan como apoderado del número de celda y el otro cuenta directamente el tdTomato que expresa NSC. Los dos ensayos se pueden realizar simultáneamente en un solo experimento y no son intensivos en mano de obra, rápidos y baratos. La estrategia descrita en esta demostración probó 57 compuestos en una pantalla primaria exploratoria para la toxicidad en un formato de placa de 96 pocillos. Tres de los éxitos se caracterizaron aún más en una respuesta de dosis de seis puntos utilizando la misma configuración de ensayo que la pantalla principal. Además de proporcionar una excelente corroboración de la toxicidad, la comparación de los resultados de los dos ensayos puede ser eficaz en la identificación de compuestos que afectan a otros aspectos del crecimiento celular.
Introduction
Una de las características más importantes que debe determinarse para un compuesto químico que tiene potencial terapéutico es su toxicidad para las células animales. Esta característica determinará si un medicamento es un buen candidato para un estudio más extenso. En la mayoría de los casos, se buscan compuestos con toxicidad mínima, pero hay situaciones en las que un compuesto con capacidad para matar tipos de células específicas es de interés, por ejemplo, fármacos antitumoraligénicos. Aunque los animales enteros son los mejores sistemas modelo para determinar la toxicidad sistémica, el costo y la mano de obra implicadas es prohibitivo cuando es necesario probar más de unos pocos compuestos. Como tal cultivo celular de mamíferos se utiliza generalmente como la alternativa más eficiente1,2. Las pantallas de fármacos de rendimiento pequeño a mediano son una modalidad importante a través de la cual se puede evaluar la toxicidad en el cultivo celular. Estas pantallas se pueden utilizar para interrogar bibliotecas anotadas dirigidas a vías de señalización individuales. El formato general de una pantalla de este tipo es probar inicialmente todos los compuestos de la biblioteca a una sola dosis (generalmente 10 m) en una pantalla exploratoria de toxicidad primaria, y luego realizar una pantalla de respuesta de dosis secundaria en profundidad para caracterizar completamente la toxicidad perfil de los aciertos de la pantalla principal. Los métodos para implementar esta estrategia se describirán aquí y proporcionarán una manera rápida, eficiente y económica de identificar y caracterizar compuestos tóxicos.
Se han desarrollado múltiples métodos para evaluar la citotoxicidad de compuestos pequeños y nanomateriales en células de mamíferos3,4. Cabe señalar que ciertos materiales pueden interactuar con el ensayo proporcionando resultados engañosos, y tales interacciones deben probarse al caracterizar los golpes de las pantallas de toxicidad4. Los ensayos de citotoxicidad incluyen exclusión azul de trypan5, ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH)6, ensayo azul de Alamar7, éster de acetoximetil calcien (AM)8y el ensayo ATP9. Todos estos ensayos miden varios aspectos del metabolismo celular que pueden servir como un proxy para el número de celda. Si bien todos ofrecen beneficios, ensayos a base de sal de tetrazolium como 3-(4,5-dimethylthizol-2-yl)-2,5-dphenyltelium bromuro (MTT), 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfopheny)-2H-tetrazolium-5-carboxyanilide sal interna (XTT)-1, y 4-(3-[4-4- El disulfato de yodofenilo]-2-[4-nitrofenilo]-2H-5-tetrazolio)-1,3-benzeno disulfonato (WST-1)10,11 proporcionan buena precisión y facilidad de uso a bajo costo. MTT, que se utilizará en esta demostración, se reduce a un formazán insoluble por una reductasa mitocondrial y la tasa de esta conversión se correlaciona fuertemente con el número de celda. Este ensayo se ha utilizado rutinariamente tanto a pequeña escala como para bibliotecas de cribado con hasta 2.000 compuestos12. El recuento directo de células por un marcador etiquetado ofrece otro método para evaluar el número celular, y a diferencia del ensayo MTT puede proporcionar información adicional sobre la dinámica del crecimiento celular. Varios algoritmos disponibles públicamente están disponibles para realizar análisis automatizados de recuento de celdas y también hay algoritmos propietarios que forman parte de paquetes de software para lectores de imágenes13,14. En esta descripción del método, una línea de células madre neuronales humanas (NSC) que ha sido editada genéticamente para expresar constitutivamente tdTomato15 servirá como una línea de prueba para comparar los resultados de viabilidad celular entre un ensayo MTT y un recuento automatizado de células ensayo en una pantalla que evalúe la toxicidad de 57 compuestos de ensayo. Aunque el objetivo principal de esta estrategia era identificar y caracterizar compuestos tóxicos, tiene el beneficio adicional de identificar potencialmente los compuestos inhibidores del crecimiento y mejorar el crecimiento y por lo tanto proporciona un método eficaz para identificar drogas que puede modular el crecimiento celular.
Protocol
Representative Results
Discussion
El objetivo principal de este artículo era describir una estrategia que pudiera identificar de manera eficiente y económica compuestos que afectan el crecimiento celular en un cribado de bajo a moderado rendimiento. Se utilizaron dos técnicas ortogonales para evaluar el número de células para aumentar la confianza en las conclusiones y ofrecer información adicional que no estaría disponible si solo se utilizara un solo ensayo. Uno de los ensayos utilizó un imager de células fluorescentes para contar directamente…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación Intramuros NINDS.
Materials
| B-27 (50X) | ThermoFisher Scientific | 17504001 | Neural stem cell medium component. |
| BenchTop pipettor | Sorenson Bioscience | 73990 | Provides ability to pipette compound library into a 96-well plate in one shot. |
| BioLite 96 well multidish | Thermo Scientific | 130188 | Any 96 well cell culture plate will work. We use these in our work. |
| Cell culture microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Visual inspection of cells to ensure proper density. |
| Cytation 5/ Imaging reader | BioTek | CYT3MFV | Used for cell imaging and absorbance readings. |
| DMSO | Fisher Scientific | 610420010 | Solvent for compounds used in screen. Dissolves MTT precipitates to facilitate absorbance measurements. |
| FGF-basic | Peprotech | 100-18B | Neural stem cell medium component. |
| GelTrex | ThermoFisher Scientific | A1413202 | Neural stem cell basement membrane matrix. Allows cells to attach to cell culture plates. |
| Gen5 3.04 | BioTek | Analysis software to determine cell counts for tdTomato expressing cells. | |
| Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | Neural stem cell medium component. |
| Microtest U-Bottom | Becton Dickinson | 3077 | Storage of compound libraries. |
| MTT | ThermoFisher Scientific | M6494 | Active assay reagent to determine cellular viability. |
| Multichannel pippette | Rainin | E8-1200 | Column-by-column addition of cell culture medium, MTT, or DMSO. |
| Neurobasal medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | Neural stem cell base medium. |
| RFP filter cube | BioTek | 1225103 | Filter in Cytation 5 used to image tdTomato expressing cells. |
| TrypLE | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Cell dissociation reagent. |
References
- National Research Council. . Toxicity Testing in the 21st century: A Vision and a Strategy. , (2007).
- Llorens, J., Li, A. A., Ceccatelli, S., Sunol, C. Strategies and tools for preventing neurotoxicity: to Test, to predict, and how to do it. Neurotoxicology. 33 (4), 796-804 (2012).
- Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. Cell proliferation and cytotoxicity assays. Current Pharmaceutical Biotechnology. 17 (14), 1213-1221 (2016).
- Ciofani, G., Danti, S., D’Alessandro, D., Moscato, S., Menciassi, A. Assessing cytotoxicity of boron nitride nanotubes: interference with the MTT assay. Biochemical and Biophysical Research Communications. 394 (2), 405-411 (2010).
- Tennant, J. R. Evaluation of the trypan blue technique for determination of cell viability. Transplantation. 2 (6), 685-694 (1964).
- Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 64 (3), 313-320 (1983).
- Ahmed, S. A., Gogal, R. M., Walsh, J. E. A new rapid and simple nonradioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine incorporation assay. Journal of Immunological Methods. 170 (2), 211-224 (1994).
- Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: Standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).
- Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).
- Malik, N., et al. Compounds with species and cell type specific toxicity identified in a 2000 compound drug screen of neural stem cells and rat mixed cortical neurons. Neurotoxicology. 45, 192-200 (2014).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), 100 (2006).
- Cerbini, T., et al. Transcription activator-like effector nuclease (TALEN)-mediated CLYBL targeting enables enhanced transgene expression and one-step generation of dual reporter human induced pluriopotent stem cell (iPSC) and neural stem cell (NSC) lines. PLoS One. 10 (1), 0116032 (2015).
- Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
- Qie, S., et al. Glutamine depletion and glucose depletion trigger growth inhibition via distinctive gene expression reprogramming. Cell Cycle. 11 (19), 3679-3690 (2012).
- Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells. Scientific Reports. 8 (1), 3029 (2018).
- Carmichael, J., DeGraff, W. G., Gazdar, A. F., Minna, J. D., Mitchell, J. B. Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing. Cancer Research. 47 (4), 936-942 (1987).
- Romijn, J. C., Verkoelen, C. F., Schroeder, F. H. Application of the MTT assay to human prostate cancer cell lines in vitro: establishment of test conditions and assessment of hormone-stimulated growth and drug-induced cytostatic and cytotoxic effects. Prostate. 12 (1), 99-110 (1988).
- Jo, H. Y., et al. The unreliability of MTT assay in the cytotoxic test of primary cultured glioblastoma cells. Experimental Neurobiology. 24 (3), 235-245 (2015).
- Kalinina, M. A., Skvortsov, D. A., Rubtsova, M. P., Komarova, E. S., Dontsova, O. A. Cytotoxicity test based on human cells labeled with fluorescent proteins: photography, and scanning for high-throughput assay. Molecular Imaging and Biology. 20 (3), 368-377 (2018).
