कम से मध्यम थ्रूपुट में संस्कृतिबद्ध मैमलियन कोशिकाओं में सेल विकास और जीवन रक्षा को प्रभावित करने वाले यौगिकों की पहचान करने के लिए एक रणनीति
Summary
यह अक्सर सुसंस्कृत कोशिकाओं पर यौगिकों का एक सेट की क्षमता cytotoxicity का आकलन करने के लिए आवश्यक है. यहाँ, हम मज़बूती से एक 96 अच्छी तरह से प्रारूप में विषाक्त यौगिकों के लिए स्क्रीन करने के लिए एक रणनीति का वर्णन.
Abstract
Cytotoxicity एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है कि जब दवाओं है कि चिकित्सीय लाभ हो सकता है का अध्ययन करने की मात्रा निर्धारित करने की जरूरत है. इस वजह से, कई दवा स्क्रीनिंग assays महत्वपूर्ण विशेषताओं में से एक के रूप में cytotoxicity का उपयोग करने के लिए व्यक्तिगत यौगिकों के लिए profiled. संस्कृति में कोशिकाओं को और अधिक महंगा और श्रम गहन पशु मॉडल में आशाजनक नेतृत्व यौगिकों पर अनुवर्ती कार्यवाही से पहले cytotoxicity का आकलन करने के लिए एक उपयोगी मॉडल हैं. हम यौगिकों कि मानव तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं (एनएससी) लाइन व्यक्त tdTomato में सेल विकास को प्रभावित की पहचान करने के लिए एक रणनीति का वर्णन. रणनीति सेल संख्या का आकलन करने के लिए दो पूरक assays का उपयोग करता है. एक परख 3 की कमी के माध्यम से काम करता है-(4,5-dimethylthizol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium ब्रोमाइड (एमटीटी) सेल नंबर के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में formazan और अन्य सीधे tdTomato NSCs व्यक्त मायने रखता है. दो परख एक ही प्रयोग में एक साथ प्रदर्शन किया जा सकता है और श्रम गहन नहीं कर रहे हैं, तेजी से, और सस्ती. इस प्रदर्शन में वर्णित रणनीति एक 96 अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप में विषाक्तता के लिए एक अन्वेषणात्मक प्राथमिक स्क्रीन में 57 यौगिकों का परीक्षण किया. हिट के तीन प्राथमिक स्क्रीन के रूप में एक ही परख सेट अप का उपयोग कर एक छह सूत्री खुराक प्रतिक्रिया में आगे विशेषता थी. विषाक्तता के लिए उत्कृष्ट पुष्टि प्रदान करने के अलावा, दो assays से परिणामों की तुलना सेल विकास के अन्य पहलुओं को प्रभावित यौगिकों की पहचान करने में प्रभावी हो सकता है.
Introduction
सबसे महत्वपूर्ण विशेषताओं में से एक है कि एक रासायनिक यौगिक है कि चिकित्सकीय क्षमता है के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए पशु कोशिकाओं के लिए अपनी विषाक्तता है. यह विशेषता निर्धारित करेगा कि क्या एक दवा अधिक व्यापक अध्ययन के लिए एक अच्छा उम्मीदवार है. ज्यादातर मामलों में, कम से कम विषाक्तता के साथ यौगिकों की मांग कर रहे हैं, लेकिन वहाँ स्थितियों में विशिष्ट सेल प्रकार को मारने की क्षमता के साथ एक यौगिक ब्याज की है, जैसे, विरोधी tumorigenic दवाओं. हालांकि पूरे जानवरों प्रणालीगत विषाक्तता निर्धारित करने के लिए सबसे अच्छा मॉडल प्रणाली रहे हैं, लागत और श्रम शामिल निषिद्ध है जब कुछ यौगिकों से अधिक का परीक्षण करने की आवश्यकता है. इस प्रकार स्तनधारी कोशिका संवर्धन का प्रयोग सामान्यतः सबसे कुशल विकल्प1,2के रूप में किया जाता है . छोटे से मध्यम थ्रूपुट दवा स्क्रीन एक महत्वपूर्ण मोडलिटी है जिसके माध्यम से सेल संस्कृति में विषाक्तता का मूल्यांकन किया जा सकता है। इन स्क्रीन व्यक्तिगत संकेतन रास्ते को लक्षित एनोटेट पुस्तकालयों पूछताछ करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस तरह के एक स्क्रीन के सामान्य प्रारूप शुरू में एक ही खुराक पर पुस्तकालय में सभी यौगिकों का परीक्षण करने के लिए है (आम तौर पर 10 $M) एक खोजात्मक प्राथमिक विषाक्तता स्क्रीन में, और फिर एक में गहराई से माध्यमिक खुराक प्रतिक्रिया स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए पूरी तरह से विषाक्तता की विशेषता प्राथमिक स्क्रीन से हिट की प्रोफ़ाइल. तरीकों को इस रणनीति को लागू करने के लिए यहाँ वर्णित किया जाएगा और एक त्वरित प्रदान, कुशल, और सस्ती तरीका की पहचान करने और विषाक्त यौगिकों की विशेषता.
स्तनधारी कोशिकाओं3,4 में छोटे यौगिकों और नैनो सामग्री की साइटोटॉक्सिसिटी का आकलन करने के लिए अनेक विधियां विकसित की गईहैं. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि कुछ सामग्री भ्रामक परिणाम प्रदान करने परख के साथ बातचीत कर सकते हैं, और इस तरह के बातचीत का परीक्षण किया जाना चाहिए जब विषाक्तता स्क्रीन से हिट विशेषता4. Cytotoxicity परख में शामिल हैं trypan नीले बहिष्करण5, लैक्टेट dehydrogenase (LDH) रिलीज परख6, Alamar नीले परख7, calcien acetoxyethyl एस्टर (AM)8, और एटीपी परख9. इन सभी assays सेल चयापचय जो सेल संख्या के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में सेवा कर सकते हैं के विभिन्न पहलुओं को मापने. जबकि सभी प्रदान लाभ, टेट्राज़ोलियम नमक-आधारित परख जैसे 3-(4,5-dimethylthizol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium ब्रोमाइड (एमटीटी), 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfopheny)-2H–ly-olium-5-carboxide-4, आयोडोफेनिल[-2-[4-निट्रोफेनिल]-2H-5-tetrazolio)-1,3-benzene disulfonet (WST-1)10,11 अच्छी सटीकता प्रदान करते हैं और कम लागत पर उपयोग में आसानी। एमटीटी, जो इस प्रदर्शन में इस्तेमाल किया जाएगा, एक mitochondrial रिडक्टस द्वारा एक अघुलनशील formazan के लिए कम है और इस रूपांतरण की दर सेल संख्या के साथ दृढ़ता से संबंधित है. इस परख का उपयोग छोटे पैमाने पर और 2,000 यौगिकों12तक की जांच पुस्तकालयों के लिए नियमित रूप से किया जाता है . एक लेबल मार्कर द्वारा कोशिकाओं की प्रत्यक्ष गिनती सेलुलर संख्या का आकलन करने के लिए एक और विधि प्रदान करता है, और MTT परख के विपरीत यह सेलुलर विकास की गतिशीलता के बारे में अतिरिक्त जानकारी प्रदान कर सकते हैं. कई सार्वजनिक रूप से उपलब्ध एल्गोरिदम स्वचालित सेल गिनती विश्लेषण करने के लिए उपलब्ध हैं और वहाँ भी स्वामित्व एल्गोरिदम कि इमेजिंग पाठकों के लिए सॉफ्टवेयर संकुल का हिस्सा हैं13,14. इस विधि विवरण में, एक मानव तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) लाइन है कि आनुवंशिक रूप से संविधान के लिए संपादित किया गया है tdTomato15 एक परीक्षण लाइन के रूप में काम करने के लिए एक MTT परख और एक स्वचालित सेल गिनती के बीच सेलुलर व्यवहार्यता परिणामों की तुलना करेंगे 57 परीक्षण यौगिकों की विषाक्तता का आकलन एक स्क्रीन में परख. हालांकि इस रणनीति का प्राथमिक लक्ष्य की पहचान करने और विषाक्त यौगिकों की विशेषता थी, यह संभावित विकास निरोधात्मक और विकास बढ़ाने यौगिकों की पहचान करने के अतिरिक्त लाभ है और इस प्रकार दवाओं की पहचान करने के लिए एक प्रभावी विधि प्रदान करता है कि सेलुलर विकास modulate कर सकते हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस लेख का प्राथमिक लक्ष्य एक रणनीति है कि कुशलतापूर्वक और सस्ते में एक कम मध्यम-throughput स्क्रीनिंग में सेल विकास को प्रभावित यौगिकों की पहचान सकता है का वर्णन करने के लिए किया गया था. दो लंबकोणीय तकनीकों क?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम एनआईडीएस Intramural अनुसंधान कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| B-27 (50X) | ThermoFisher Scientific | 17504001 | Neural stem cell medium component. |
| BenchTop pipettor | Sorenson Bioscience | 73990 | Provides ability to pipette compound library into a 96-well plate in one shot. |
| BioLite 96 well multidish | Thermo Scientific | 130188 | Any 96 well cell culture plate will work. We use these in our work. |
| Cell culture microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Visual inspection of cells to ensure proper density. |
| Cytation 5/ Imaging reader | BioTek | CYT3MFV | Used for cell imaging and absorbance readings. |
| DMSO | Fisher Scientific | 610420010 | Solvent for compounds used in screen. Dissolves MTT precipitates to facilitate absorbance measurements. |
| FGF-basic | Peprotech | 100-18B | Neural stem cell medium component. |
| GelTrex | ThermoFisher Scientific | A1413202 | Neural stem cell basement membrane matrix. Allows cells to attach to cell culture plates. |
| Gen5 3.04 | BioTek | Analysis software to determine cell counts for tdTomato expressing cells. | |
| Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | Neural stem cell medium component. |
| Microtest U-Bottom | Becton Dickinson | 3077 | Storage of compound libraries. |
| MTT | ThermoFisher Scientific | M6494 | Active assay reagent to determine cellular viability. |
| Multichannel pippette | Rainin | E8-1200 | Column-by-column addition of cell culture medium, MTT, or DMSO. |
| Neurobasal medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | Neural stem cell base medium. |
| RFP filter cube | BioTek | 1225103 | Filter in Cytation 5 used to image tdTomato expressing cells. |
| TrypLE | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Cell dissociation reagent. |
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