Biosyntes av en flavonol från en Flavanone genom att etablera en en-Pot Bienzymatisk kaskad
Summary
Härledningen av en flavonol är avgörande för dess tillämpning inom hälso-och sjukvården och livsmedelsindustrin. Här ger vi ett detaljerat protokoll för biosyntesen av en flavonol från en flavanone och diskutera de avgörande stegen och dess fördelar jämfört med andra metoder.
Abstract
Flavonoler är en stor subklass av flavonoider med en mängd olika biologiska och farmakologiska aktiviteter. Här, vi ger en metod för in vitro enzymatisk syntes av en flavonol. I denna metod, Atf3h och Atfls1, två viktiga gener i den biosyntetiska vägen av flavonoler, klonas och överuttrycks i Escherichia coli. De rekombinanta enzymerna renas via en affinitetskolonn och därefter etableras en bienzymatisk kaskad i en specifik syntetisk buffert. Två flavonoler syntetiseras i detta system som exempel och bestäms av TLC och HPLC/LC/MS analyser. Metoden visar uppenbara fördelar i härledning av flavonoler över andra metoder. Det är tid-och arbetsbesparande och mycket kostnadseffektivt. Reaktionen är lätt att kontrolleras noggrant och därmed skalas upp för massproduktion. Mål produkten kan renas enkelt på grund av de enkla komponenterna i systemet. Emellertid, detta system är vanligtvis begränsad till produktion av en flavonol från en flavanone.
Introduction
Flavonoler är en stor underklass av växt flavonoider och är involverade i växternas utveckling och pigmentering1,2,3. Ännu viktigare, dessa föreningar besitter ett brett spektrum av hälso-positiva aktiviteter, såsom anti-cancer4,5, anti-oxidativ6, anti-inflammatorisk7, antifetma8, blodtryckssänkande9 och minnes återkallnings egenskaper10, vilket leder till ett stort antal studier av dessa växthärledda sekundära metaboliter. Traditionellt är dessa föreningar huvudsakligen härrör från växt utvinning med organiska lösningsmedel. Men på grund av deras mycket låga halter i växter11,12,13, produktionskostnaden för de flesta flavonoler fortfarande hög, vilket innebär stora restriktioner för deras tillämpning inom vården och livsmedels Industrin.
Under de senaste decennierna har forskarna utvecklat ett ganska antal metoder för att härleda flavonoider14,15. Emellertid, kemisk syntes av dessa komplicerade molekyler besitter en mängd inneboende nackdelar16. Det kräver inte bara giftiga reagenser och extrema reaktions förhållanden, men också många steg för att producera ett mål flavonoid förening14,17. Dessutom är en annan viktig utmaning i denna strategi den kirala syntesen av aktiva flavonoid molekyler. Därför är det inte en idealisk strategi för att producera flavonoider i kommersiell skala via kemisk syntes16,17.
Nyligen har forskarna utvecklat en lovande alternativ strategi för att producera dessa komplicerade naturliga föreningar genom att Engineering mikrober med en väg för flavonoid biosyntes18,19,20, 21 , 22, som framgångsrikt har dechiffrerats i växter23. Till exempel införde Duan et al. en biosyntetisk väg in i spirande jästen Saccharomyces cerevisiae att producera kaempferol (KMF)24. Malla et al. producerade astragalin, en glykosylerad flavonol, genom att införaflavanone 3-hydroxylas (f3h), flavonol syntas (fls1), och UDP-glukos: flavonoid 3-O-glukosyltransferas UGT78K1 gener till Escherichia coliBL21 (de3)17. Även om det finns en hel del paradigm, inte alla genetiskt modifierade mikrober producera produkter av intresse på grund av komplexiteten i en cellulära plattform, inkompatibilitet mellan artificiellt syntetiserade genetiska element och värdar, den hämmande effekt av målprodukter mot värdceller, och instabilitet i en konstruerad cellulära systemet själv16.
En annan lovande alternativ strategi för flavonoid produktion är att etablera en multienzymatisk kaskad in vitro-. Cheng et al. har rapporterat att enterocin polypetider kan framgångsrikt syntetiseras genom att samla en komplett enzymatisk väg i en pott25. Denna cell-fri syntetisk strategi kringgår begränsningarna av en mikrobiell produktion fabriken och därmed är möjligt för att producera vissa flavonoider i stor mängd16.
Nyligen har vi framgångsrikt utvecklat ett bienzym syntetiskt system för att omvandla naringenin (NRN) till KMF i en pott16. Här beskriver vi detta system i stora detaljer och de metoder som ingår i analysering av produkterna. Vi presenterar också två exempel som använder detta system för att producera KMF från NRN och quercetin (QRC) från eriodictyol (ERD). Dessutom diskuterar vi viktiga steg i denna metod och framtida forsknings riktningar i biosyntesen av flavonoider.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ganska många studier är inriktade på härledning av flavonoler på grund av deras potentiella tillämpning inom hälso-och sjukvård och livsmedelsindustrin. Men traditionella växt utvinning med organiska lösningsmedel och kemisk syntes besitter inneboende nackdelar, som begränsar deras användning i produktionen av flavonoler. Här, Vi rapporterar en detaljerad metod för att producera en flavonol från en flavanone i en kruka genom att etablera en in vitro bienzymatisk kaskad. De kritiska stegen i detta protokoll…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes ekonomiskt av Yangzhou University särskilt utsedda professor start-up fonder, Jiangsu särskilt utsedda professor start-up fonder, sex Talent Peaks projekt i Jiangsu-provinsen (Grant No. 2014-SWYY-016), och ett projekt som finansieras av den prioriterade akademiska program utvecklingen i Jiangsu högre utbildningsanstalter (veterinärmedicin). Vi tackar testcentret för Yangzhou University för HPLC och MS analyser av flavonoider.
Materials
| 2× Pfu MasterMix | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0717A | PCR amplification of genes with high fidelity |
| Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system | Agilent Technologies, Inc | N/A | an equipment for analysis of flavonoids by HPLC/MS |
| Agilent MassHunter Workstation (version B.03.01) | Agilent Technologies, Inc | N/A | a software for collection of the data from the Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system |
| dihydrokaempferol | Sigma-Aldrich Co. LLC | 91216 | intermediate product for producing kaempferol from naringenin |
| dihydroquercetin | Sichuan Provincial Standard Substance Center for Chinese Herbal Medicine | PCS0371 | intermediate product for producing quercetin from eriodictyol |
| DNA Clean-up Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW2301 | purification of PCR-amplified or gel-purified DNA |
| eriodictyol | Shanghai Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd. | B21160 | substrate for producing quercetin |
| Escherichia coli BL21(DE3) | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0809 | bacteria strain for expressing target genes |
| Escherichia coli DH5α | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0808 | bacteria strain for plasmid proliferation |
| FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze-Dry System | Labconco Corporation | 7740020 | an equipment for freeze-drying of flavonoids dissolved in organic solvent |
| Gel Extraction Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW2302 | purification of a DNA band from an agarose gel |
| Gel Imaging System | Shanghai Tanon Science & Technology Co. Ltd. | Tanon- 2500 |
an equipment for visualization of DNA band on an agarose gel or flavonoid spot on a polyamide TLC plate |
| GenElute Plasmid Miniprep Kit | Sigma-Aldrich Co. LLC | PLN350-1KT | minipreparation of plasmids |
| kaempferol | Sigma-Aldrich Co. LLC | 60010 | final reaction product and standard substance |
| MassHunter Quanlitative Analysis (version B.01.04) | Agilent Technologies, Inc | N/A | a software for analysis of HPLC/LC/MS data |
| NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-8000-GL | an equipment for determination of DNA/RNA concentration |
| naringenin | Sigma-Aldrich Co. LLC | N5893 | substrate for producing kaempferol |
| Ni-IDA Agarose Resin | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0010 | purification of His-tagged fusion proteins |
| pET-32a(+) | Novagen | 69015-3 | plasmid for cloning and expressing target genes |
| plasmid sequencing | GENEWIZ Suzhou | N/A | sequencing of recombinant plasmids |
| primer synthesis | GENEWIZ Suzhou | N/A | synthesis of PCR primers |
| quercetin | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd. | Q111273 | final reaction product and standard substance |
| SuperRT cDNA Synthesis Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0741 | synthesis of the first strand of cDNA from total RNA |
| T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0016 | ligation of an insert into a linearized vector DNA |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | isolation of total RNA |
| Vector NTI Advance | Thermo Fisher Scientific | 12605099 | a software for PCR primer design and DNA sequence analysis |
| Xcalibur v2.0.7 | Thermo Fisher Scientific | N/A | a software for analysis of HPLC data |
References
- Falcone Ferreyra, M. L., Rius, S. P., Casati, P. Flavonoids: biosynthesis, biological functions, and biotechnological applications. Frontiers in Plant Science. 3, 222 (2012).
- Fang, F., Tang, K., Huang, W. D. Changes of flavonol synthase and flavonol contents during grape berry development. European Food Research and Technology. 237 (4), 529-540 (2013).
- Cui, B., et al. Anthocyanins and flavonols are responsible for purple color of Lablab purpureus (L.) sweet pods. Plant Physiology and Biochemistry. 103, 183-190 (2016).
- Li, X., et al. A new class of flavonol-based anti-prostate cancer agents: Design, synthesis, and evaluation in cell models. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 26 (17), 4241-4245 (2016).
- Kim, H., et al. Regulation of Wnt signaling activity for growth suppression induced by quercetin in 4T1 murine mammary cancer cells. International Journal of Oncology. 43 (4), 1319-1325 (2013).
- Kimura, H., et al. Antioxidant activities and structural characterization of flavonol O-glycosides from seeds of Japanese horse chestnut (Aesculus turbinata BLUME). Food Chemistry. 228, 348-355 (2017).
- Cassidy, A., et al. Higher dietary anthocyanin and flavonol intakes are associated with anti-inflammatory effects in a population of US adults. The American Journal of Clinical Nutrition. 102 (1), 172-181 (2015).
- Chao, H. C., Tsai, P. F., Lee, S. C., Lin, Y. S., Wu, M. C. Effects of Myricetin-Containing Ethanol Solution on High-Fat Diet Induced Obese Rats. Journal of Food Science. 82 (8), 1947-1952 (2017).
- Serban, M. C., et al. Effects of Quercetin on Blood Pressure: A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials. Journal of the American Heart Association. 5 (7), (2016).
- Nakagawa, T., et al. Improvement of memory recall by quercetin in rodent contextual fear conditioning and human early-stage Alzheimer’s disease patients. Neuroreport. 27 (9), 671-676 (2016).
- Muthukrishnan, S. D., Kaliyaperumal, A., Subramaniyan, A. Identification and determination of flavonoids, carotenoids and chlorophyll concentration in Cynodon dactylon (L.) by HPLC analysis. Natural Product Research. 29 (8), 785-790 (2015).
- Agar, O. T., et al. Comparative Studies on Phenolic Composition, Antioxidant, Wound Healing and Cytotoxic Activities of Selected Achillea L. Species Growing in Turkey. Molecules. 20 (10), 17976-18000 (2015).
- Yang, R. Y., Lin, S., Kuo, G. Content and distribution of flavonoids among 91 edible plant species. Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition. 17, 275-279 (2008).
- Tang, L. J., Zhang, S. F., Yang, J. Z., Gao, W. T. New Synthetic Methods of Flavones. Chinese Journal of Organic Chemistry. 24 (8), 882-889 (2004).
- Lu, Y. H., et al. Synthesis of luteolin and kaempferol (author’s transl). Yao Xue Xue Bao. 15 (8), 477-481 (1980).
- Zhang, Z., et al. Development and Optimization of an In vitro Multienzyme Synthetic System for Production of Kaempferol from Naringenin. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (31), 8272-8279 (2018).
- Malla, S., Pandey, R. P., Kim, B. G., Sohng, J. K. Regiospecific modifications of naringenin for astragalin production in Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering. 110 (9), 2525-2535 (2013).
- Zhu, S., Wu, J., Du, G., Zhou, J., Chen, J. Efficient synthesis of eriodictyol from L-tyrosine in Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology. 80 (10), 3072-3080 (2014).
- Trantas, E., Panopoulos, N., Ververidis, F. Metabolic engineering of the complete pathway leading to heterologous biosynthesis of various flavonoids and stilbenoids in Saccharomyces cerevisiae. Metabolic Engineering. 11 (6), 355-366 (2009).
- Miyahisa, I., et al. Combinatorial biosynthesis of flavones and flavonols in Escherichia coli. Applied Microbiology and Biotechnology. 71 (1), 53-58 (2006).
- Leonard, E., Yan, Y., Koffas, M. A. Functional expression of a P450 flavonoid hydroxylase for the biosynthesis of plant-specific hydroxylated flavonols in Escherichia coli. Metabolic Engineering. 8 (2), 172-181 (2006).
- Koopman, F., et al. De novo production of the flavonoid naringenin in engineered Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories. 11, 155 (2012).
- Winkel-Shirley, B. Flavonoid biosynthesis. A colorful model for genetics, biochemistry, cell biology, and biotechnology. Plant Physiology. 126 (2), 485-493 (2001).
- Duan, L., et al. Biosynthesis and engineering of kaempferol in Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories. 16 (1), 165 (2017).
- Cheng, Q., Xiang, L., Izumikawa, M., Meluzzi, D., Moore, B. S. Enzymatic total synthesis of enterocin polyketides. Nature Chemical Biology. 3 (9), 557-558 (2007).
- Connolly, M. A., Clausen, P. A., Lazar, J. G. Preparation of RNA from plant tissue using trizol. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of RNA from cells and tissues by Acid phenol-guanidinium thiocyanate-chloroform extraction. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Construction of cDNA Libraries Stage 1: Synthesis of First-strand cDNA Catalyzed by Reverse Transcriptase. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Directional cloning into plasmid vectors. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Expression of Cloned Genes in E. coli Using IPTG-inducible Promoters. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Histidine-tagged Proteins by Immobilized Ni2+ Absorption Chromatography. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Halbwirth, H., et al. Measuring flavonoid enzyme activities in tissues of fruit species. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (11), 4983-4987 (2009).
- Prescott, A. G., Stamford, N. P., Wheeler, G., Firmin, J. L. In vitro properties of a recombinant flavonol synthase from Arabidopsis thaliana. Phytochemistry. 60 (6), 589-593 (2002).
