Summary

Biosynthese van een Flavonol van een Flavanone door het opzetten van een One-pot Bienzymatische Cascade

Published: August 14, 2019
doi:

Summary

De afleiding van een Flavonol is cruciaal voor de toepassing ervan in de gezondheidszorg en de voedingsindustrie. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor de biosynthese van een Flavonol van een flavanone en bespreken de cruciale stappen en de voordelen ervan ten opzichte van andere benaderingen.

Abstract

Flavonolen zijn een belangrijke subklasse van flavonoïden met een verscheidenheid aan biologische en farmacologische activiteiten. Hier, we bieden een methode voor de in vitro enzymatische synthese van een Flavonol. In deze methode worden Atf3h en Atfls1, twee belangrijke genen in de biosynthetische route van de flavonolen, gekloond en overexpressie in Escherichia coli. De recombinant enzymen worden gezuiverd via een affiniteits kolom en vervolgens wordt een bienzymatische Cascade vastgesteld in een specifieke synthetische buffer. Twee flavonolen worden gesynthetiseerd in dit systeem als voorbeelden en bepaald door TLC-en HPLC/LC/MS-analyses. De methode geeft duidelijke voordelen in de afleiding van flavonolen over andere benaderingen. Het is tijd-en arbeidsbesparing en zeer kosteneffectief. De reactie is gemakkelijk om nauwkeurig te worden gecontroleerd en dus opgeschaald voor massaproductie. Het doel product kan gemakkelijk worden gezuiverd door de eenvoudige componenten in het systeem. Echter, dit systeem is meestal beperkt tot de productie van een Flavonol van een flavanone.

Introduction

Flavonolen zijn een belangrijke subklasse van planten flavonoïden en zijn betrokken bij de ontwikkeling van planten en pigmentatie1,2,3. Belangrijker, deze verbindingen bezitten een breed scala van gezondheid-heilzame activiteiten, zoals anti-kanker4,5, anti-oxidatieve6, anti-inflammatoire7, antiobesity8, anti-hypertensieve9 , en geheugen terugroepen eigenschappen10, wat leidt tot een groot aantal studies over deze plant afgeleide secundaire metabolieten. Traditioneel, deze verbindingen zijn voornamelijk afgeleid van planten extractie met behulp van organische oplosmiddelen. Echter, vanwege hun zeer lage inhoud in planten11,12,13, de productiekosten voor de meeste flavonolen blijft hoog, die grote beperkingen oplegt aan hun toepassing in de gezondheidszorg en het voedsel Industrie.

In de afgelopen decennia, wetenschappers hebben een flink aantal methoden ontwikkeld om te ontlenen flavonoïden14,15. Chemische synthese van deze gecompliceerde moleculen bezit echter een verscheidenheid aan intrinsieke nadelen16. Het vereist niet alleen giftige reagentia en extreme reactieomstandigheden, maar ook vele stappen voor de productie van een doel flavonoïde samengestelde14,17. Bovendien, een andere belangrijke uitdaging in deze strategie is de chirale synthese van actieve flavonoïde moleculen. Daarom is het geen ideale strategie om flavonoïden op commerciële schaal te produceren via chemische synthese16,17.

Onlangs hebben wetenschappers een veelbelovende alternatieve strategie ontwikkeld om deze gecompliceerde natuurlijke verbindingen te produceren door technische microben met een traject voor flavonoïde biosynthese18,19,20, 21 , 22, die met succes is ontcijferd in planten23. Duan et al. introduceerde bijvoorbeeld een biosynthetische route in de ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae om kaempferol (kmf)24te produceren. Malla et al. geproduceerd astragalin, een geglycosyleerde Flavonol, door de invoering vanflavanone 3-hydroxylase (f3h), Flavonol synthase (fls1), en UDP-glucose: Flavonoïde 3-O-glucosyltransferase UGT78K1 genen in Escherichia coliBL21 (DE3)17. Ook al zijn er nogal wat paradigma’s, niet alle genetisch gemanipuleerde microben produceren de producten van belang als gevolg van de complexiteit van een cellulair platform, de onverenigbaarheid tussen kunstmatig gesynthetiseerde genetische elementen en hosts, de remmende effect van doel producten tegen gastheer cellen, en de instabiliteit van een Engineered cellulaire systeem zelf16.

Een andere veelbelovende alternatieve strategie voor de productie van flavonoïden is het vestigen van een multienzymatische Cascade in vitro. Cheng et al. hebben gemeld dat enterocin polyketides met succes kan worden gesynthetiseerd door het assembleren van een volledige enzymatische route in één pot25. Deze cel-vrije synthetische strategie omzeilt de beperkingen van een microbiële productiefabriek en is dus haalbaar voor het produceren van sommige flavonoïden in grote hoeveelheid16.

Onlangs hebben we met succes een bienzyme synthetisch systeem ontwikkeld om met (NRN) om te zetten in KMF in één pot16. Hier beschrijven we dit systeem in grote details en de methoden die betrokken zijn bij het analyseren van de producten. We presenteren ook twee voorbeelden die dit systeem gebruiken voor het produceren van KMF van NRN en quercetine (qrc) van eriodictyol (ERD). Daarnaast bespreken we cruciale stappen van deze methode en toekomstige onderzoeksrichtingen in de biosynthese van flavonoïden.

Protocol

1. Isoleer totaal RNA uit plantenweefsels26,27 Homogeniseren de plantenweefsels. Verzamel 100 mg van een vers plantenweefsel (bijv. 4 weken oude zaailingen uit Arabidopsis thaliana). Vries het weefsel en een stamper en mortel met vloeibare stikstof, gevolgd door het slijpen van het weefsel in poedervorm. Voeg 1 mL RNA-isolatie reagens (Zie tabel met materialen) toe aan de mortel. Het reagens wordt onmiddellij…

Representative Results

F3H en FLS1 zijn twee belangrijke sleutel enzymen bij de omzetting van een flavanone in een Flavonol in planten, zoals weergegeven in Figuur 1. Voor de ontwikkeling van een in vitro biosynthetisch systeem voor de productie van een Flavonol uit een flavanone, Atf3h (GenBank toetredingsnr. NM_ 114983.3) en Atfls1 (GenBank toetredingsnr. NM_ 120951.3) genen werden gekloond uit de zaailingen van 4 weken oude a. thaliana in een prokaryot…

Discussion

Een flink aantal studies zijn gericht op de afleiding van flavonolen als gevolg van hun potentiële toepassing in de gezondheidszorg en voedingsmiddelenindustrie. Echter, traditionele planten extractie met behulp van organische oplosmiddelen en chemische synthese bezitten intrinsieke nadelen, die hun gebruik in de productie van flavonolen beperken. Hier rapporteren we een gedetailleerde methode voor het produceren van een Flavonol van een flavanone in één pot door het opzetten van een in vitro bienzymatische Cascade. D…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd financieel gesteund door de Universiteit van Yangzhou, speciaal benoemd professor start-up funds, Jiangsu speciaal benoemd professor start-up funds, Six talent Peaks project in de provincie Jiangsu (Grant No. 2014-SWYY-016), en een project gefinancierd door de prioritaire academische programma ontwikkeling van de Jiangsu hogeronderwijsinstellingen (diergeneeskunde). We danken het testcentrum van de Universiteit van Yangzhou voor HPLC en MS-analyses van flavonoïden.

Materials

2× Pfu MasterMix Beijing CoWin Biotech Co., Ltd CW0717A PCR amplification of genes with high fidelity
Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system Agilent Technologies, Inc N/A an equipment for analysis of flavonoids by HPLC/MS
Agilent MassHunter Workstation (version B.03.01) Agilent Technologies, Inc N/A a software for collection of the data from the Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system
dihydrokaempferol Sigma-Aldrich Co. LLC 91216 intermediate product for producing kaempferol from naringenin
dihydroquercetin Sichuan Provincial Standard Substance Center for Chinese Herbal Medicine PCS0371 intermediate product for producing quercetin from eriodictyol
DNA Clean-up Kit Beijing CoWin Biotech Co., Ltd CW2301 purification of PCR-amplified or gel-purified DNA
eriodictyol Shanghai Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd. B21160 substrate for producing quercetin
Escherichia coli BL21(DE3) Beijing CoWin Biotech Co., Ltd CW0809 bacteria strain for expressing target genes
Escherichia coli DH5α Beijing CoWin Biotech Co., Ltd CW0808 bacteria strain for plasmid proliferation
FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze-Dry System Labconco Corporation 7740020 an equipment for freeze-drying of flavonoids dissolved in organic solvent
Gel Extraction Kit Beijing CoWin Biotech Co., Ltd CW2302 purification of a DNA band from an agarose gel
Gel Imaging System Shanghai Tanon Science & Technology Co. Ltd. Tanon-
2500
an equipment for visualization of DNA band on an agarose gel or flavonoid spot on a polyamide TLC plate
GenElute Plasmid Miniprep Kit Sigma-Aldrich Co. LLC PLN350-1KT minipreparation of plasmids
kaempferol Sigma-Aldrich Co. LLC 60010 final reaction product and standard substance
MassHunter Quanlitative Analysis (version B.01.04) Agilent Technologies, Inc N/A a software for analysis of HPLC/LC/MS data
NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-8000-GL an equipment for determination of DNA/RNA concentration
naringenin Sigma-Aldrich Co. LLC N5893 substrate for producing kaempferol
Ni-IDA Agarose Resin Beijing CoWin Biotech Co., Ltd CW0010 purification of His-tagged fusion proteins
pET-32a(+) Novagen 69015-3 plasmid for cloning and expressing target genes
plasmid sequencing GENEWIZ Suzhou N/A sequencing of recombinant plasmids
primer synthesis GENEWIZ Suzhou N/A synthesis of PCR primers
quercetin Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd. Q111273 final reaction product and standard substance
SuperRT cDNA Synthesis Kit Beijing CoWin Biotech Co., Ltd CW0741 synthesis of the first strand of cDNA from total RNA
T4 DNA Ligase Thermo Fisher Scientific EL0016 ligation of an insert into a linearized vector DNA
Trizol Thermo Fisher Scientific 15596018 isolation of total RNA
Vector NTI Advance Thermo Fisher Scientific 12605099 a software for PCR primer design and DNA sequence analysis
Xcalibur v2.0.7 Thermo Fisher Scientific N/A a software for analysis of HPLC data

References

  1. Falcone Ferreyra, M. L., Rius, S. P., Casati, P. Flavonoids: biosynthesis, biological functions, and biotechnological applications. Frontiers in Plant Science. 3, 222 (2012).
  2. Fang, F., Tang, K., Huang, W. D. Changes of flavonol synthase and flavonol contents during grape berry development. European Food Research and Technology. 237 (4), 529-540 (2013).
  3. Cui, B., et al. Anthocyanins and flavonols are responsible for purple color of Lablab purpureus (L.) sweet pods. Plant Physiology and Biochemistry. 103, 183-190 (2016).
  4. Li, X., et al. A new class of flavonol-based anti-prostate cancer agents: Design, synthesis, and evaluation in cell models. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 26 (17), 4241-4245 (2016).
  5. Kim, H., et al. Regulation of Wnt signaling activity for growth suppression induced by quercetin in 4T1 murine mammary cancer cells. International Journal of Oncology. 43 (4), 1319-1325 (2013).
  6. Kimura, H., et al. Antioxidant activities and structural characterization of flavonol O-glycosides from seeds of Japanese horse chestnut (Aesculus turbinata BLUME). Food Chemistry. 228, 348-355 (2017).
  7. Cassidy, A., et al. Higher dietary anthocyanin and flavonol intakes are associated with anti-inflammatory effects in a population of US adults. The American Journal of Clinical Nutrition. 102 (1), 172-181 (2015).
  8. Chao, H. C., Tsai, P. F., Lee, S. C., Lin, Y. S., Wu, M. C. Effects of Myricetin-Containing Ethanol Solution on High-Fat Diet Induced Obese Rats. Journal of Food Science. 82 (8), 1947-1952 (2017).
  9. Serban, M. C., et al. Effects of Quercetin on Blood Pressure: A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials. Journal of the American Heart Association. 5 (7), (2016).
  10. Nakagawa, T., et al. Improvement of memory recall by quercetin in rodent contextual fear conditioning and human early-stage Alzheimer’s disease patients. Neuroreport. 27 (9), 671-676 (2016).
  11. Muthukrishnan, S. D., Kaliyaperumal, A., Subramaniyan, A. Identification and determination of flavonoids, carotenoids and chlorophyll concentration in Cynodon dactylon (L.) by HPLC analysis. Natural Product Research. 29 (8), 785-790 (2015).
  12. Agar, O. T., et al. Comparative Studies on Phenolic Composition, Antioxidant, Wound Healing and Cytotoxic Activities of Selected Achillea L. Species Growing in Turkey. Molecules. 20 (10), 17976-18000 (2015).
  13. Yang, R. Y., Lin, S., Kuo, G. Content and distribution of flavonoids among 91 edible plant species. Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition. 17, 275-279 (2008).
  14. Tang, L. J., Zhang, S. F., Yang, J. Z., Gao, W. T. New Synthetic Methods of Flavones. Chinese Journal of Organic Chemistry. 24 (8), 882-889 (2004).
  15. Lu, Y. H., et al. Synthesis of luteolin and kaempferol (author’s transl). Yao Xue Xue Bao. 15 (8), 477-481 (1980).
  16. Zhang, Z., et al. Development and Optimization of an In vitro Multienzyme Synthetic System for Production of Kaempferol from Naringenin. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (31), 8272-8279 (2018).
  17. Malla, S., Pandey, R. P., Kim, B. G., Sohng, J. K. Regiospecific modifications of naringenin for astragalin production in Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering. 110 (9), 2525-2535 (2013).
  18. Zhu, S., Wu, J., Du, G., Zhou, J., Chen, J. Efficient synthesis of eriodictyol from L-tyrosine in Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology. 80 (10), 3072-3080 (2014).
  19. Trantas, E., Panopoulos, N., Ververidis, F. Metabolic engineering of the complete pathway leading to heterologous biosynthesis of various flavonoids and stilbenoids in Saccharomyces cerevisiae. Metabolic Engineering. 11 (6), 355-366 (2009).
  20. Miyahisa, I., et al. Combinatorial biosynthesis of flavones and flavonols in Escherichia coli. Applied Microbiology and Biotechnology. 71 (1), 53-58 (2006).
  21. Leonard, E., Yan, Y., Koffas, M. A. Functional expression of a P450 flavonoid hydroxylase for the biosynthesis of plant-specific hydroxylated flavonols in Escherichia coli. Metabolic Engineering. 8 (2), 172-181 (2006).
  22. Koopman, F., et al. De novo production of the flavonoid naringenin in engineered Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories. 11, 155 (2012).
  23. Winkel-Shirley, B. Flavonoid biosynthesis. A colorful model for genetics, biochemistry, cell biology, and biotechnology. Plant Physiology. 126 (2), 485-493 (2001).
  24. Duan, L., et al. Biosynthesis and engineering of kaempferol in Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories. 16 (1), 165 (2017).
  25. Cheng, Q., Xiang, L., Izumikawa, M., Meluzzi, D., Moore, B. S. Enzymatic total synthesis of enterocin polyketides. Nature Chemical Biology. 3 (9), 557-558 (2007).
  26. Connolly, M. A., Clausen, P. A., Lazar, J. G. Preparation of RNA from plant tissue using trizol. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
  27. Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of RNA from cells and tissues by Acid phenol-guanidinium thiocyanate-chloroform extraction. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
  28. Sambrook, J., Russell, D. W. Construction of cDNA Libraries Stage 1: Synthesis of First-strand cDNA Catalyzed by Reverse Transcriptase. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
  29. Sambrook, J., Russell, D. W. Directional cloning into plasmid vectors. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
  30. Sambrook, J., Russell, D. W. Expression of Cloned Genes in E. coli Using IPTG-inducible Promoters. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
  31. Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Histidine-tagged Proteins by Immobilized Ni2+ Absorption Chromatography. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
  32. Halbwirth, H., et al. Measuring flavonoid enzyme activities in tissues of fruit species. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (11), 4983-4987 (2009).
  33. Prescott, A. G., Stamford, N. P., Wheeler, G., Firmin, J. L. In vitro properties of a recombinant flavonol synthase from Arabidopsis thaliana. Phytochemistry. 60 (6), 589-593 (2002).

Play Video

Cite This Article
Zhang, Z., Fan, S., Chen, Z., He, Y., Huang, M., Ding, L., Zhang, Y., Chen, L., Zhang, X. Biosynthesis of a Flavonol from a Flavanone by Establishing a One-pot Bienzymatic Cascade. J. Vis. Exp. (150), e59336, doi:10.3791/59336 (2019).

View Video