ביוסינתזה של פלאנונול מתוך Flavanone על ידי הקמת מדורגת ביאנזיטית בסיר אחד
Summary
הנגזרת של פלברול היא חיונית ליישומו בתחום הבריאות ותעשיית המזון. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור יוסינטזה של פלאורול מן flavanone ולדון את הצעדים הקריטיים ואת יתרונותיה על פני גישות אחרות.
Abstract
פלונוולים הם מחלקת מחשוב של פלונונואידים עם מגוון פעילויות ביולוגיות ופרמקולוגית. כאן אנו מספקים שיטה לסינתזה האנזימטית של פלאורול. בשיטה זו, Atf3h ו- Atfls1, שני גנים מרכזיים בשביל הביוסינתטי של פלאוולים, משובטים ומבוטאים בתוך אסאנכיה קולי. האנזימים הרקומביננטי מטוהרים באמצעות עמודת זיקה ומוקמת בתוך מאגר סינתטי מסוים. שני פלאוולים מסונתז במערכת זו כדוגמאות ונקבעים על-ידי הניתוח לבדיקות ובדיקות/מערכות המשך. השיטה מציגה יתרונות ברורים בנגזרת של פלאוולים על פני גישות אחרות. זה זמן וחסכון בעבודה. ומאוד חסכוני התגובה היא קלה להיות נשלט באופן מדויק ובכך מוקטן לייצור המוני. מוצר היעד ניתן לטהר בקלות בשל הרכיבים הפשוטים במערכת. עם זאת, מערכת זו מוגבלת בדרך כלל לייצור של פלאוננול מתוך flavanone.
Introduction
פלאוולים הם מחלקת משנה מרכזית של פלאונואידים צמח והם מעורבים בפיתוח הצמח פיגמנטציה1,2,3. חשוב יותר, תרכובות אלה בעלי מגוון רחב של פעילויות בריאות מועילות, כגון אנטי סרטן4,5, נגד חמצוני6, אנטי דלקתיות7, אנטי השמנה8, נגד יתר לחץ דם9 , וזיכרון להיזכר מאפיינים10, המוביל למספר רב של מחקרים על אלה הצמח-מטבוליטים הנגזרים משני. באופן מסורתי, תרכובות אלה נגזרות בעיקר מחילוץ הצמח באמצעות ממיסים אורגניים. עם זאת, בשל התוכן הנמוך מאוד שלהם בצמחים11,12,13, עלות הייצור עבור רוב פלאוולים נשאר גבוה, אשר מטיל הגבלות גדולות על היישום שלהם בריאות ומזון תעשייה.
במהלך העשורים האחרונים, מדענים פיתחו מספר רב של שיטות כדי להפיק פלבונונואידים14,15. עם זאת, סינתזה כימית של אלה מולקולות מסובכות בעל מגוון של חסרונות פנימיים16. זה דורש לא רק ריאגנטים רעילים ותנאי תגובה קיצוניים, אלא גם צעדים רבים כדי לייצר מתחם פלאואיד מטרה14,17. יתר על כן, אתגר חשוב נוסף באסטרטגיה זו הוא סינתזה כיראאל של מולקולות פלאואיד פעיל. לכן, זה לא אסטרטגיה אידיאלית כדי לייצר פלבנואידים בקנה מידה מסחרי באמצעות סינתזה כימית16,17.
לאחרונה, מדענים פיתחו אסטרטגיה חלופית מבטיח לייצר אלה תרכובות טבעיות מסובך על ידי חיידקים הנדסה עם מסלול עבור ביואואיד ביולוגי18,19,20, מיכל בן 21 , 22, אשר פענחו בהצלחה בצמחים23. לדוגמה, דואן ואח ‘ הציגו מסלול ביוסינתטי בתוך הסרביסים שמרים לייצר kaempferol (kmf)24. מאלון ואח ‘ הופק אסטרגליב, פלאוסינט מניב, על-ידי החדרתflavanone 3-הידרוקסילאז (f3h), פאוננול סטנדרטים (fls1), ו-UDP-גלוקוז: פלונואיד 3-O-גלוקוסילאז UGT78K1 גנים לתוך האנהכיה קולי BL21 (DE3)17. למרות שיש די הרבה תפיסות, לא כל החיידקים מהונדסים גנטית לייצר את המוצרים של עניין בשל המורכבות של פלטפורמת הסלולר, אי התאמה בין אלמנטים גנטיים מסונתז מלאכותי מארחים, העכבות השפעה של מוצרי היעד נגד תאים מארחים, ואת חוסר היציבות של מערכת סלולרית הנדסה עצמה16.
עוד אסטרטגיה חלופית מבטיח ייצור פלונואיד היא להקים אשד רב אנזימטית בתוך מבחנה. צ ‘ נג ואח ‘ דיווחו כי בידור polyketides יכול להיות מסונתז בהצלחה על ידי הרכבת מסלול אנזימטי מלאה בסיר אחד25. זו אסטרטגיה סינתטית ללא תא לעקוף את ההגבלות של מפעל ייצור חיידקים וכך ניתן לייצר פלבנואידים כמות גדולה16.
לאחרונה, פיתחנו בהצלחה מערכת ביואנזים סינתטי כדי להמיר נרינגב (NRN) לתוך KMF בסיר אחד16. כאן, אנו מתארים את המערכת בפרטים הגדולים והשיטות הכרוכות בניתוח המוצרים. אנו מציגים גם שתי דוגמאות המשתמשות במערכת זו כדי לייצר kmf מ nrn ו-קוורצטין (qrc) מ eriodictyol (לורד). בנוסף, אנו דנים צעדים קריטיים של שיטה זו וכיווני מחקר עתידיים בביוסינתזה של פלבנואידים.
Protocol
Representative Results
Discussion
די מספר מחקרים מתמקדים בנגזרת של פלאוולים בשל היישום הפוטנציאלי שלהם בתחום הבריאות והמזון. עם זאת, מיצוי הצמח המסורתי באמצעות ממיסים אורגניים וסינתזה כימית בעלי חסרונות פנימיים, אשר מגבילים את השימוש שלהם בייצור של פלאוולים. כאן, אנו מדווחים על שיטה מפורטת להפקת פלאורול מתוך flavanone בסיר אח…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו היה נתמך כספית על ידי אוניברסיטת יאנגז’ו מונה מיוחד פרופסור סטארט-up קרנות, ג’יאנגסו מונה מיוחד פרופסור סטארט-up קרנות, שישה כישרון פסגות פרויקט במחוז ג’יאנגסו (גרנט No. 2014-SWYY-016), ו פרויקט ממומן על ידי התוכנית האקדמית עדיפות פיתוח של ג’יאנגסו מוסדות השכלה גבוהה (רפואה וטרינרית). אנו מודים למרכז בדיקות של אוניברסיטת יאנגז’ו לבדיקות וניתוח MS של פלונונואידים.
Materials
| 2× Pfu MasterMix | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0717A | PCR amplification of genes with high fidelity |
| Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system | Agilent Technologies, Inc | N/A | an equipment for analysis of flavonoids by HPLC/MS |
| Agilent MassHunter Workstation (version B.03.01) | Agilent Technologies, Inc | N/A | a software for collection of the data from the Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system |
| dihydrokaempferol | Sigma-Aldrich Co. LLC | 91216 | intermediate product for producing kaempferol from naringenin |
| dihydroquercetin | Sichuan Provincial Standard Substance Center for Chinese Herbal Medicine | PCS0371 | intermediate product for producing quercetin from eriodictyol |
| DNA Clean-up Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW2301 | purification of PCR-amplified or gel-purified DNA |
| eriodictyol | Shanghai Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd. | B21160 | substrate for producing quercetin |
| Escherichia coli BL21(DE3) | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0809 | bacteria strain for expressing target genes |
| Escherichia coli DH5α | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0808 | bacteria strain for plasmid proliferation |
| FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze-Dry System | Labconco Corporation | 7740020 | an equipment for freeze-drying of flavonoids dissolved in organic solvent |
| Gel Extraction Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW2302 | purification of a DNA band from an agarose gel |
| Gel Imaging System | Shanghai Tanon Science & Technology Co. Ltd. | Tanon- 2500 |
an equipment for visualization of DNA band on an agarose gel or flavonoid spot on a polyamide TLC plate |
| GenElute Plasmid Miniprep Kit | Sigma-Aldrich Co. LLC | PLN350-1KT | minipreparation of plasmids |
| kaempferol | Sigma-Aldrich Co. LLC | 60010 | final reaction product and standard substance |
| MassHunter Quanlitative Analysis (version B.01.04) | Agilent Technologies, Inc | N/A | a software for analysis of HPLC/LC/MS data |
| NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-8000-GL | an equipment for determination of DNA/RNA concentration |
| naringenin | Sigma-Aldrich Co. LLC | N5893 | substrate for producing kaempferol |
| Ni-IDA Agarose Resin | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0010 | purification of His-tagged fusion proteins |
| pET-32a(+) | Novagen | 69015-3 | plasmid for cloning and expressing target genes |
| plasmid sequencing | GENEWIZ Suzhou | N/A | sequencing of recombinant plasmids |
| primer synthesis | GENEWIZ Suzhou | N/A | synthesis of PCR primers |
| quercetin | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd. | Q111273 | final reaction product and standard substance |
| SuperRT cDNA Synthesis Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0741 | synthesis of the first strand of cDNA from total RNA |
| T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0016 | ligation of an insert into a linearized vector DNA |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | isolation of total RNA |
| Vector NTI Advance | Thermo Fisher Scientific | 12605099 | a software for PCR primer design and DNA sequence analysis |
| Xcalibur v2.0.7 | Thermo Fisher Scientific | N/A | a software for analysis of HPLC data |
References
- Falcone Ferreyra, M. L., Rius, S. P., Casati, P. Flavonoids: biosynthesis, biological functions, and biotechnological applications. Frontiers in Plant Science. 3, 222 (2012).
- Fang, F., Tang, K., Huang, W. D. Changes of flavonol synthase and flavonol contents during grape berry development. European Food Research and Technology. 237 (4), 529-540 (2013).
- Cui, B., et al. Anthocyanins and flavonols are responsible for purple color of Lablab purpureus (L.) sweet pods. Plant Physiology and Biochemistry. 103, 183-190 (2016).
- Li, X., et al. A new class of flavonol-based anti-prostate cancer agents: Design, synthesis, and evaluation in cell models. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 26 (17), 4241-4245 (2016).
- Kim, H., et al. Regulation of Wnt signaling activity for growth suppression induced by quercetin in 4T1 murine mammary cancer cells. International Journal of Oncology. 43 (4), 1319-1325 (2013).
- Kimura, H., et al. Antioxidant activities and structural characterization of flavonol O-glycosides from seeds of Japanese horse chestnut (Aesculus turbinata BLUME). Food Chemistry. 228, 348-355 (2017).
- Cassidy, A., et al. Higher dietary anthocyanin and flavonol intakes are associated with anti-inflammatory effects in a population of US adults. The American Journal of Clinical Nutrition. 102 (1), 172-181 (2015).
- Chao, H. C., Tsai, P. F., Lee, S. C., Lin, Y. S., Wu, M. C. Effects of Myricetin-Containing Ethanol Solution on High-Fat Diet Induced Obese Rats. Journal of Food Science. 82 (8), 1947-1952 (2017).
- Serban, M. C., et al. Effects of Quercetin on Blood Pressure: A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials. Journal of the American Heart Association. 5 (7), (2016).
- Nakagawa, T., et al. Improvement of memory recall by quercetin in rodent contextual fear conditioning and human early-stage Alzheimer’s disease patients. Neuroreport. 27 (9), 671-676 (2016).
- Muthukrishnan, S. D., Kaliyaperumal, A., Subramaniyan, A. Identification and determination of flavonoids, carotenoids and chlorophyll concentration in Cynodon dactylon (L.) by HPLC analysis. Natural Product Research. 29 (8), 785-790 (2015).
- Agar, O. T., et al. Comparative Studies on Phenolic Composition, Antioxidant, Wound Healing and Cytotoxic Activities of Selected Achillea L. Species Growing in Turkey. Molecules. 20 (10), 17976-18000 (2015).
- Yang, R. Y., Lin, S., Kuo, G. Content and distribution of flavonoids among 91 edible plant species. Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition. 17, 275-279 (2008).
- Tang, L. J., Zhang, S. F., Yang, J. Z., Gao, W. T. New Synthetic Methods of Flavones. Chinese Journal of Organic Chemistry. 24 (8), 882-889 (2004).
- Lu, Y. H., et al. Synthesis of luteolin and kaempferol (author’s transl). Yao Xue Xue Bao. 15 (8), 477-481 (1980).
- Zhang, Z., et al. Development and Optimization of an In vitro Multienzyme Synthetic System for Production of Kaempferol from Naringenin. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (31), 8272-8279 (2018).
- Malla, S., Pandey, R. P., Kim, B. G., Sohng, J. K. Regiospecific modifications of naringenin for astragalin production in Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering. 110 (9), 2525-2535 (2013).
- Zhu, S., Wu, J., Du, G., Zhou, J., Chen, J. Efficient synthesis of eriodictyol from L-tyrosine in Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology. 80 (10), 3072-3080 (2014).
- Trantas, E., Panopoulos, N., Ververidis, F. Metabolic engineering of the complete pathway leading to heterologous biosynthesis of various flavonoids and stilbenoids in Saccharomyces cerevisiae. Metabolic Engineering. 11 (6), 355-366 (2009).
- Miyahisa, I., et al. Combinatorial biosynthesis of flavones and flavonols in Escherichia coli. Applied Microbiology and Biotechnology. 71 (1), 53-58 (2006).
- Leonard, E., Yan, Y., Koffas, M. A. Functional expression of a P450 flavonoid hydroxylase for the biosynthesis of plant-specific hydroxylated flavonols in Escherichia coli. Metabolic Engineering. 8 (2), 172-181 (2006).
- Koopman, F., et al. De novo production of the flavonoid naringenin in engineered Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories. 11, 155 (2012).
- Winkel-Shirley, B. Flavonoid biosynthesis. A colorful model for genetics, biochemistry, cell biology, and biotechnology. Plant Physiology. 126 (2), 485-493 (2001).
- Duan, L., et al. Biosynthesis and engineering of kaempferol in Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories. 16 (1), 165 (2017).
- Cheng, Q., Xiang, L., Izumikawa, M., Meluzzi, D., Moore, B. S. Enzymatic total synthesis of enterocin polyketides. Nature Chemical Biology. 3 (9), 557-558 (2007).
- Connolly, M. A., Clausen, P. A., Lazar, J. G. Preparation of RNA from plant tissue using trizol. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of RNA from cells and tissues by Acid phenol-guanidinium thiocyanate-chloroform extraction. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Construction of cDNA Libraries Stage 1: Synthesis of First-strand cDNA Catalyzed by Reverse Transcriptase. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Directional cloning into plasmid vectors. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Expression of Cloned Genes in E. coli Using IPTG-inducible Promoters. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Histidine-tagged Proteins by Immobilized Ni2+ Absorption Chromatography. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Halbwirth, H., et al. Measuring flavonoid enzyme activities in tissues of fruit species. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (11), 4983-4987 (2009).
- Prescott, A. G., Stamford, N. P., Wheeler, G., Firmin, J. L. In vitro properties of a recombinant flavonol synthase from Arabidopsis thaliana. Phytochemistry. 60 (6), 589-593 (2002).
