एक एक पॉट Bienzymatic Cascade की स्थापना के द्वारा एक Flavanone से एक Flavonol के Biosynthesis
Summary
एक flavonol के व्युत्पत्ति स्वास्थ्य देखभाल और खाद्य उद्योग में अपने आवेदन के लिए महत्वपूर्ण है. यहाँ, हम एक flavanone से एक flavonol के biosynthesis के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं और महत्वपूर्ण कदम और अन्य दृष्टिकोण पर इसके लाभ पर चर्चा.
Abstract
Flavonols जैविक और औषधीय गतिविधियों की एक किस्म के साथ flavonoids का एक प्रमुख उपवर्ग हैं. यहाँ, हम एक flavonol के इन विट्रो एंजाइमी संश्लेषण के लिए एक विधि प्रदान करते हैं. इस विधि में, एट्फ3ह और एफ्ल्स1, फ्लेवोनोल्स के जैव संश्लेषी मार्ग में दो प्रमुख जीन, एशेरीचिया कोलीमें क्लोन और अतिसंह ित किए जाते हैं. रिकॉमबिनेंट एंजाइमों एक संबंध स्तंभ के माध्यम से शुद्ध कर रहे हैं और फिर एक bienzymatic झरना एक विशिष्ट सिंथेटिक बफर में स्थापित किया गया है. दो flavonols उदाहरण के रूप में इस प्रणाली में संश्लेषित कर रहे हैं और टीएलसी और HPLC/LC/MS विश्लेषण द्वारा निर्धारित. विधि अन्य दृष्टिकोण पर flavonols के व्युत्पत्ति में स्पष्ट लाभ प्रदर्शित करता है. यह समय और श्रम की बचत और अत्यधिक लागत प्रभावी है. प्रतिक्रिया को सही ढंग से नियंत्रित किया जा आसान है और इस प्रकार बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए बढ़ाया. लक्ष्य उत्पाद प्रणाली में सरल घटकों के कारण आसानी से शुद्ध किया जा सकता है. हालांकि, इस प्रणाली को आम तौर पर एक flavanone से एक flavonol के उत्पादन के लिए प्रतिबंधित है.
Introduction
फ्लेवोनोलपाद पादप फ्लेवोनोइड्स का एक प्रमुख उपवर्ग है और यह पादप विकास तथा रंजकता1,2,3में शामिल है . इससे भी महत्वपूर्ण बात, इन यौगिकों में स्वास्थ्य-लाभदायक गतिविधियों की एक विस्तृत श्रृंखला है, जैसे कि एंटी-कैंसर4,5, एंटी-ऑक्सीडेटिव6, एंटी-इंफ्लेमेटरी7, एंटीबेसिटी8, एंटी-हाइपरटेंसिव9 , और स्मृति याद गुण10, इन संयंत्र व्युत्पन्न माध्यमिक चयापचयों पर अध्ययन की एक बड़ी संख्या के लिए अग्रणी. परंपरागत रूप से, इन यौगिकों मुख्य रूप से कार्बनिक सॉल्वैंट्स का उपयोग कर संयंत्र निष्कर्षण से प्राप्त कर रहे हैं। हालांकि, पौधों में उनकी बहुत कम सामग्री के कारण11,12,13, सबसे flavonols के लिए उत्पादन लागत उच्च रहता है, जो स्वास्थ्य देखभाल और भोजन में उनके आवेदन पर काफी प्रतिबंध लगाता है उद्योग.
पिछले दशकों के दौरान वैज्ञानिकों ने फ्लेवोनोइड्स14,15को प्राप्त करने के लिए अनेक तरीके विकसित किए हैं . तथापि, इन जटिल अणुओं के रासायनिक संश्लेषण में विभिन्न प्रकार के आंतरिक नुकसानहोतेहैं। यह न केवल विषाक्त अभिकर्मकों और चरम प्रतिक्रिया की स्थिति की आवश्यकता है , लेकिन यह भी कई कदम एक लक्ष्य flavonoid यौगिक14,17का उत्पादन करने के लिए . इसके अलावा, इस रणनीति में एक और महत्वपूर्ण चुनौती सक्रिय flavonoid अणुओं के चिरल संश्लेषण है. अतः रासायनिक संश्लेषण16,17के माध्यम से वाणिज्यिक स्तर पर फ्लेवोनोइड्स का उत्पादन करना कोई आदर्श कार्यनीति नहीं है।
हाल ही में, वैज्ञानिकों ने इन जटिल प्राकृतिक यौगिकों का उत्पादन करने के लिए एक आशाजनक वैकल्पिक रणनीति विकसित की है, जिसमें फ्लैवोनॉयड बायोसिंथेसिस18,19,20, 21 , 22, जिसे23पौधों में सफलतापूर्वक समझा गया है . उदाहरण के लिए, Duan एट अल. नवोदित खमीर Saccharomyces cerevisiae में एक जैव संश्लेषण मार्ग की शुरुआत केलिएम्पफेरॉल (KMF)24का उत्पादन करने के लिए . मल्ल एट अल. का उत्पादन एस्ट्रागैलिन, एक ग्लाइकोसिलेटिड फ्लेवोनोल,flavanone 3-hydroxylase (f3h), flavonol synthase(fla1),और UDP-ग्लूकोज:flavonoid 3-O-glucosyltransferase UGT78K1 जीन में शुरू करने से Escherichia कोलाईBL21(DE3)17| हालांकि वहाँ काफी कुछ प्रतिमान हैं, नहीं सभी आनुवंशिक रूप से इंजीनियर रोगाणुओं एक सेलुलर मंच की जटिलता के कारण ब्याज के उत्पादों का उत्पादन, कृत्रिम रूप से संश्लेषित आनुवंशिक तत्वों और मेजबानों के बीच असंगति, निरोधात्मक मेजबान कोशिकाओं के खिलाफ लक्ष्य उत्पादों का प्रभाव, और एक इंजीनियर सेलुलर प्रणाली की अस्थिरता ही16.
flavonoid उत्पादन के लिए एक और आशाजनक वैकल्पिक रणनीति इन विट्रो में एक multienzymatic झरना स्थापित करने के लिए है. चेंग एट अल की सूचना दी है कि enterocin polyketides सफलतापूर्वक एक बर्तन25में एक पूर्ण एंजाइमी मार्ग कोडांतरण द्वारा संश्लेषित किया जा सकता है. यह सेल-मुक्त संश्लेषी कार्यनीति माइक्रोबियल उत्पादन कारखाने के प्रतिबंधों को दरकिनारकरती है और इस प्रकार बड़ी मात्रा में कुछ फ्लेवोनोइड्स के उत्पादन के लिए संभव है 16 .
हाल ही में, हमने एक बर्तन16में नारिनजेनिन (एनआरएन) को केएमएफ में परिवर्तित करने के लिए एक द्विएंजाइम संश्लेषक प्रणाली सफलतापूर्वक विकसित की है। यहाँ, हम महान विवरण और उत्पादों का विश्लेषण करने में शामिल तरीकों में इस प्रणाली का वर्णन. हम भी दो उदाहरण है कि इस प्रणाली का उपयोग NRN और क्वेरसेटिन से KMF का उत्पादन (QRC) eriodictyol (ERD) से प्रस्तुत करते हैं. इसके अलावा, हम flavonoids के biosynthesis में इस विधि और भविष्य के अनुसंधान दिशाओं के महत्वपूर्ण चरणों पर चर्चा.
Protocol
Representative Results
Discussion
काफी अध्ययन के एक नंबर स्वास्थ्य देखभाल और खाद्य उद्योग में उनके संभावित आवेदन के कारण flavonols के व्युत्पत्ति पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं. हालांकि, कार्बनिक सॉल्वैंट्स और रासायनिक संश्लेषण का उपयोग कर प?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम वित्तीय रूप से Yangzhou विश्वविद्यालय विशेष रूप से नियुक्त प्रोफेसर स्टार्ट-अप फंड, Jiangsu विशेष रूप से नियुक्त प्रोफेसर स्टार्ट-अप फंड, Jiangsu प्रांत में छह प्रतिभा चोटियों परियोजना (ग्रेंट नंबर 2014-SWYY-016) द्वारा समर्थित किया गया था, और एक परियोजना द्वारा वित्त पोषित Jiangsu उच्च शिक्षा संस्थानों (Veterinary चिकित्सा) की प्राथमिकता शैक्षणिक कार्यक्रम विकास. हम HPLC और एमएस flavonoids के विश्लेषण के लिए Yangzhou विश्वविद्यालय के परीक्षण केंद्र धन्यवाद.
Materials
| 2× Pfu MasterMix | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0717A | PCR amplification of genes with high fidelity |
| Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system | Agilent Technologies, Inc | N/A | an equipment for analysis of flavonoids by HPLC/MS |
| Agilent MassHunter Workstation (version B.03.01) | Agilent Technologies, Inc | N/A | a software for collection of the data from the Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system |
| dihydrokaempferol | Sigma-Aldrich Co. LLC | 91216 | intermediate product for producing kaempferol from naringenin |
| dihydroquercetin | Sichuan Provincial Standard Substance Center for Chinese Herbal Medicine | PCS0371 | intermediate product for producing quercetin from eriodictyol |
| DNA Clean-up Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW2301 | purification of PCR-amplified or gel-purified DNA |
| eriodictyol | Shanghai Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd. | B21160 | substrate for producing quercetin |
| Escherichia coli BL21(DE3) | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0809 | bacteria strain for expressing target genes |
| Escherichia coli DH5α | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0808 | bacteria strain for plasmid proliferation |
| FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze-Dry System | Labconco Corporation | 7740020 | an equipment for freeze-drying of flavonoids dissolved in organic solvent |
| Gel Extraction Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW2302 | purification of a DNA band from an agarose gel |
| Gel Imaging System | Shanghai Tanon Science & Technology Co. Ltd. | Tanon- 2500 |
an equipment for visualization of DNA band on an agarose gel or flavonoid spot on a polyamide TLC plate |
| GenElute Plasmid Miniprep Kit | Sigma-Aldrich Co. LLC | PLN350-1KT | minipreparation of plasmids |
| kaempferol | Sigma-Aldrich Co. LLC | 60010 | final reaction product and standard substance |
| MassHunter Quanlitative Analysis (version B.01.04) | Agilent Technologies, Inc | N/A | a software for analysis of HPLC/LC/MS data |
| NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-8000-GL | an equipment for determination of DNA/RNA concentration |
| naringenin | Sigma-Aldrich Co. LLC | N5893 | substrate for producing kaempferol |
| Ni-IDA Agarose Resin | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0010 | purification of His-tagged fusion proteins |
| pET-32a(+) | Novagen | 69015-3 | plasmid for cloning and expressing target genes |
| plasmid sequencing | GENEWIZ Suzhou | N/A | sequencing of recombinant plasmids |
| primer synthesis | GENEWIZ Suzhou | N/A | synthesis of PCR primers |
| quercetin | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd. | Q111273 | final reaction product and standard substance |
| SuperRT cDNA Synthesis Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0741 | synthesis of the first strand of cDNA from total RNA |
| T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0016 | ligation of an insert into a linearized vector DNA |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | isolation of total RNA |
| Vector NTI Advance | Thermo Fisher Scientific | 12605099 | a software for PCR primer design and DNA sequence analysis |
| Xcalibur v2.0.7 | Thermo Fisher Scientific | N/A | a software for analysis of HPLC data |
References
- Falcone Ferreyra, M. L., Rius, S. P., Casati, P. Flavonoids: biosynthesis, biological functions, and biotechnological applications. Frontiers in Plant Science. 3, 222 (2012).
- Fang, F., Tang, K., Huang, W. D. Changes of flavonol synthase and flavonol contents during grape berry development. European Food Research and Technology. 237 (4), 529-540 (2013).
- Cui, B., et al. Anthocyanins and flavonols are responsible for purple color of Lablab purpureus (L.) sweet pods. Plant Physiology and Biochemistry. 103, 183-190 (2016).
- Li, X., et al. A new class of flavonol-based anti-prostate cancer agents: Design, synthesis, and evaluation in cell models. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 26 (17), 4241-4245 (2016).
- Kim, H., et al. Regulation of Wnt signaling activity for growth suppression induced by quercetin in 4T1 murine mammary cancer cells. International Journal of Oncology. 43 (4), 1319-1325 (2013).
- Kimura, H., et al. Antioxidant activities and structural characterization of flavonol O-glycosides from seeds of Japanese horse chestnut (Aesculus turbinata BLUME). Food Chemistry. 228, 348-355 (2017).
- Cassidy, A., et al. Higher dietary anthocyanin and flavonol intakes are associated with anti-inflammatory effects in a population of US adults. The American Journal of Clinical Nutrition. 102 (1), 172-181 (2015).
- Chao, H. C., Tsai, P. F., Lee, S. C., Lin, Y. S., Wu, M. C. Effects of Myricetin-Containing Ethanol Solution on High-Fat Diet Induced Obese Rats. Journal of Food Science. 82 (8), 1947-1952 (2017).
- Serban, M. C., et al. Effects of Quercetin on Blood Pressure: A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials. Journal of the American Heart Association. 5 (7), (2016).
- Nakagawa, T., et al. Improvement of memory recall by quercetin in rodent contextual fear conditioning and human early-stage Alzheimer’s disease patients. Neuroreport. 27 (9), 671-676 (2016).
- Muthukrishnan, S. D., Kaliyaperumal, A., Subramaniyan, A. Identification and determination of flavonoids, carotenoids and chlorophyll concentration in Cynodon dactylon (L.) by HPLC analysis. Natural Product Research. 29 (8), 785-790 (2015).
- Agar, O. T., et al. Comparative Studies on Phenolic Composition, Antioxidant, Wound Healing and Cytotoxic Activities of Selected Achillea L. Species Growing in Turkey. Molecules. 20 (10), 17976-18000 (2015).
- Yang, R. Y., Lin, S., Kuo, G. Content and distribution of flavonoids among 91 edible plant species. Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition. 17, 275-279 (2008).
- Tang, L. J., Zhang, S. F., Yang, J. Z., Gao, W. T. New Synthetic Methods of Flavones. Chinese Journal of Organic Chemistry. 24 (8), 882-889 (2004).
- Lu, Y. H., et al. Synthesis of luteolin and kaempferol (author’s transl). Yao Xue Xue Bao. 15 (8), 477-481 (1980).
- Zhang, Z., et al. Development and Optimization of an In vitro Multienzyme Synthetic System for Production of Kaempferol from Naringenin. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (31), 8272-8279 (2018).
- Malla, S., Pandey, R. P., Kim, B. G., Sohng, J. K. Regiospecific modifications of naringenin for astragalin production in Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering. 110 (9), 2525-2535 (2013).
- Zhu, S., Wu, J., Du, G., Zhou, J., Chen, J. Efficient synthesis of eriodictyol from L-tyrosine in Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology. 80 (10), 3072-3080 (2014).
- Trantas, E., Panopoulos, N., Ververidis, F. Metabolic engineering of the complete pathway leading to heterologous biosynthesis of various flavonoids and stilbenoids in Saccharomyces cerevisiae. Metabolic Engineering. 11 (6), 355-366 (2009).
- Miyahisa, I., et al. Combinatorial biosynthesis of flavones and flavonols in Escherichia coli. Applied Microbiology and Biotechnology. 71 (1), 53-58 (2006).
- Leonard, E., Yan, Y., Koffas, M. A. Functional expression of a P450 flavonoid hydroxylase for the biosynthesis of plant-specific hydroxylated flavonols in Escherichia coli. Metabolic Engineering. 8 (2), 172-181 (2006).
- Koopman, F., et al. De novo production of the flavonoid naringenin in engineered Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories. 11, 155 (2012).
- Winkel-Shirley, B. Flavonoid biosynthesis. A colorful model for genetics, biochemistry, cell biology, and biotechnology. Plant Physiology. 126 (2), 485-493 (2001).
- Duan, L., et al. Biosynthesis and engineering of kaempferol in Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories. 16 (1), 165 (2017).
- Cheng, Q., Xiang, L., Izumikawa, M., Meluzzi, D., Moore, B. S. Enzymatic total synthesis of enterocin polyketides. Nature Chemical Biology. 3 (9), 557-558 (2007).
- Connolly, M. A., Clausen, P. A., Lazar, J. G. Preparation of RNA from plant tissue using trizol. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of RNA from cells and tissues by Acid phenol-guanidinium thiocyanate-chloroform extraction. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Construction of cDNA Libraries Stage 1: Synthesis of First-strand cDNA Catalyzed by Reverse Transcriptase. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Directional cloning into plasmid vectors. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Expression of Cloned Genes in E. coli Using IPTG-inducible Promoters. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Histidine-tagged Proteins by Immobilized Ni2+ Absorption Chromatography. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Halbwirth, H., et al. Measuring flavonoid enzyme activities in tissues of fruit species. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (11), 4983-4987 (2009).
- Prescott, A. G., Stamford, N. P., Wheeler, G., Firmin, J. L. In vitro properties of a recombinant flavonol synthase from Arabidopsis thaliana. Phytochemistry. 60 (6), 589-593 (2002).
