अलगाव और मास साइटोमेट्री द्वारा सेलुलर प्रोटीन अभिव्यक्ति के सेल चक्र विशिष्ट विश्लेषण के लिए माउस त्वचा Keratincytes के दाग
Summary
इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे माउस मॉडल से त्वचा keratinocytes को अलग करने के लिए, धातु टैग एंटीबॉडी के साथ दाग के लिए, और बड़े पैमाने पर cytometry द्वारा दाग कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए विभिन्न सेल चक्र चरणों में ब्याज की प्रोटीन की अभिव्यक्ति पैटर्न प्रोफ़ाइल.
Abstract
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य माउस त्वचा के epidermis से अलग एकल कोशिकाओं का उपयोग कर एक सेल चक्र पर निर्भर तरीके से प्रोटीन अभिव्यक्ति परिवर्तन का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए है. वहाँ सात महत्वपूर्ण कदम हैं: dermis से बाह्य त्वचा की जुदाई, बाह्य त्वचा का पाचन, cisplatin के साथ epidermal सेल आबादी के धुंधला, नमूना barcoding, सेल चक्र मार्करों और प्रोटीन के लिए धातु टैग एंटीबॉडी के साथ धुंधला ब्याज, बड़े पैमाने पर साइटोमेट्री द्वारा धातु टैग एंटीबॉडी का पता लगाने, और विभिन्न सेल चक्र चरणों में अभिव्यक्ति का विश्लेषण. हिस्टोलॉजिकल तरीकों पर इस दृष्टिकोण का लाभ सेल चक्र के विभिन्न चरणों में एक एकल सेल में की अभिव्यक्ति पैटर्न परख करने की क्षमता है। यह दृष्टिकोण प्रोटीन अभिव्यक्ति के बहुचर सहसंबंध विश्लेषण के लिए भी अनुमति देता है जो हिस्टोलॉजिकल/इमेजिंग विधियों की तुलना में अधिक परिमाणात्मक है। इस प्रोटोकॉल का नुकसान यह है कि एकल कोशिकाओं के निलंबन की जरूरत है, जो ऊतक वर्गों के धुंधला द्वारा प्रदान की स्थान जानकारी के नुकसान में परिणाम है. इस दृष्टिकोण को कच्चे सेल निलंबन में विभिन्न प्रकार के सेल प्रकारों की पहचान करने के लिए अतिरिक्त मार्कर ों को शामिल करने की भी आवश्यकता हो सकती है। इस प्रोटोकॉल के आवेदन hyperplastic त्वचा रोग मॉडल के विश्लेषण में स्पष्ट है. इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल वंश विशेष एंटीबॉडी के अलावा द्वारा कोशिकाओं के विशिष्ट उप-प्रकार के विश्लेषण के लिए अनुकूलित किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, स्टेम सेल)। इस प्रोटोकॉल भी अन्य प्रयोगात्मक प्रजातियों में त्वचा कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
Introduction
कोशिका चक्र चरणों के साथ जीन अभिव्यक्ति का सहसंबंध कैंसर जैसे हाइपरप्लास्टिक रोगों के पशु मॉडलों के विश्लेषण में एक चुनौती बनी हुई है। इस चुनौती का एक हिस्सा प्रसार के मार्करों के साथ ब्याज (पीओआई) के प्रोटीन का सह-पता लगाना है। Proliferative कोशिकाओं G1, एस, G2, और एम Ki67 सहित विभिन्न सेल चक्र चरणों में पाया जा सकता है प्रसार के सबसे अधिक इस्तेमाल किया मार्करों में से एक है और सेल चक्र के सभी चरणों में व्यक्त किया है. इसका उपयोग मानव और माउस के ऊतकों1,2,3दोनों के विश्लेषण में व्यापक रूप से किया गया है . हालांकि, अन्य सामान्य प्रसार मार्करों की तरह, Ki67 व्यक्तिगत सेल चक्र चरणों विचार नहीं है. एक अधिक सटीक दृष्टिकोण सक्रिय रूप से अपने जीनोम (यानी, एस चरण)4,5नकल कर रहे हैं कि कोशिकाओं में Bromodeoxyuridine (BrdU) की तरह थाइमिडीन न्यूक्लिओटाइड एनालॉग के निगमन का उपयोग करता है। न्यूक्लिओटाइड एनालॉग के उपयोग के लिए एक दोष विश्लेषण से पहले जानवरों घंटे रहने के लिए उन्हें प्रशासन की जरूरत है. की67 और BrdU आमतौर पर एंटीबॉडी के उपयोग से निश्चित ऊतक वर्गों पर पाया जाता है. इस दृष्टिकोण का एक लाभ यह है कि POIs के स्थान ऊतक वास्तुकला के भीतर पता लगाया जा सकता है (उदा., त्वचा epidermis के बेसल परत). इस दृष्टिकोण भी ऊतक वियोजन है कि जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं की आवश्यकता नहीं है. एक नुकसान यह है कि ऊतक निर्धारण या OCT जमे हुए या पैराफिन सेक्शनिंग के लिए ऊतक के प्रसंस्करण एंटीबॉडी लक्ष्य (यानी, प्रतिजनों) को समाप्त कर सकते हैं। प्रतिजनों की पुनः प्राप्ति के लिए आम तौर पर गर्मी या ऊतक पाचन की आवश्यकता होती है। दाग तीव्रता का परिमाण भी चुनौतीपूर्ण हो सकता है। यह धुंधला, अनुभाग मोटाई, संकेत का पता लगाने, और प्रयोगकर्ता पूर्वाग्रह में बदलाव के कारण है. इसके अलावा, मार्करों की एक सीमित संख्या में सबसे विशिष्ट प्रयोगशाला setups में एक साथ पता लगाया जा सकता है. फिर भी, नए मल्टीप्लेक्स धुंधला दृष्टिकोण इन सीमाओं को दूर करने का वादा करता है; उदाहरण हैं इमेजिंग द्रव्यमान साइटोमेट्री और टायरामाइड संकेत प्रवर्धन6,7.
प्रवाह साइटोमेट्री बढ़ते कोशिकाओं का पता लगाने के लिए एक और शक्तिशाली तकनीक है। यह एक ही कोशिकाओं में मार्करों के मल्टीप्लेक्स का पता लगाने के लिए अनुमति देता है, लेकिन सबसे गैर hematopoietic सेल प्रकार के लिए ऊतक वियोजन की आवश्यकता है. प्रोलिफरेटिंग कोशिकाओं का विश्लेषण नियमित रूप से डीएनए को बांधने वाले रंगों के उपयोग द्वारा किया जाता है (उदा., प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई))8। प्रवाह कोशिकामिति भी कोशिका चक्र चरणों का एक अधिक सटीक निर्धारण की अनुमति देता है जब BrdU निगमन9का पता लगाने के साथ युग्मित . हालांकि एक शक्तिशाली दृष्टिकोण, BrdU/PI प्रवाह साइटोमेट्री अपने नुकसान है. यह चरण-विशिष्ट एंटीबॉडी को शामिल किए बिना जी2/एम और जी0/जी1 चरणों को हल करने में असमर्थ है। हालांकि, एंटीबॉडी की संख्या है कि इस्तेमाल किया जा सकता सेलुलर autofluorscence द्वारा सीमित है, फ्लोरोफोर उत्सर्जन के वर्णक्रमीय spillover, और मुआवजा नियंत्रण के उपयोग. यह सीमा POIs के साथ सेल चक्र मार्करों की अभिव्यक्ति का सह-पता लगाने के लिए इसे और अधिक चुनौतीपूर्ण और कठिन चिह्नित करती है। एक अधिक सुविधाजनक दृष्टिकोण द्रव्यमान साइटोमेट्री10,11का उपयोग करने के लिए है . इस तकनीक धातु संयुग्मी एंटीबॉडी है कि एक संकीर्ण पता लगाने स्पेक्ट्रम है का उपयोग करता है. एक बार कोशिकाओं धातु टैग एंटीबॉडी के साथ दाग रहे हैं, वे वाष्पीकृत कर रहे हैं, और कोशिका मिति समय के उड़ान (CyTOF) मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पता चला धातुओं. इन गुणों के कारण, द्रव्यमान कोशिकामिति मौजूदा प्लेटफार्मों10,11का उपयोग करके मल्टीप्लेक्स का पता लगाने में सक्षम बनाता है। इसके अलावा, यह धातुओं है कि कीमती एंटीबॉडी की बचत में परिणाम के साथ नमूने बारकोड करने के लिए संभव है, जबकि नमूना करने के लिए नमूना धुंधला परिवर्तनशीलता को कम करने. दूसरी ओर, बड़े पैमाने पर साइटोमेट्री कई नुकसान है. गैर रक्त व्युत्पन्न कोशिकाओं के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध धातु टैग एंटीबॉडी की एक सीमित संख्या में हैं. डीएनए सामग्री की मात्रा फ्लोरोसेंट डीएनए रंगों के उपयोग की तुलना में कम संवेदनशील है और बड़े पैमाने पर साइटोमेट्री फ्लोरोसेंट प्रवाह साइटोमेट्री की तुलना में संकेत का पता लगाने की एक कम गतिशील रेंज है।
यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल माउस त्वचा से नव अलग keratincytes (KCs) से सेल चक्र गतिशीलता का विश्लेषण और इन कोशिकाओं में सेल चक्र विशिष्ट प्रोटीन अभिव्यक्ति की विशेषता जन साइटोमेट्री का उपयोग करने के लिए डिजाइन किया गया था. इस प्रोटोकॉल का उपयोग सुसंस्कृत कोशिकाओं के साथ भी किया जा सकता है या अन्य सेल प्रकारों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस पेपर में उल्लिखित प्रोटोकॉल लगभग 8 ज में पूरा किया जा सकता है। अंतिम परिणाम KCs में समृद्ध कोशिकाओं का निलंबन है कि एक सेल चक्र पर निर्भर तरीके से प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए विश्लेषण किया जा सकता है. पिछ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के लिए समर्थन त्वचा विज्ञान विभाग से आया, कोलोराडो विश्वविद्यालय में पुनर्योजी चिकित्सा के लिए गेट्स केंद्र और कोलोराडो विश्वविद्यालय (यूसी) त्वचा रोग केंद्र Morphology और Phenotyping कोर (NIAMS P30 AR057212). लेखकों यूसी कैंसर केंद्र प्रवाह Cytometry साझा संसाधन और समर्थन अनुदान स्वीकार करते हैं (NCI P30 CA046934) बड़े पैमाने पर cytometer के संचालन के लिए और करेन हेल्म और क्रिस्टीन बच्चों के लिए आभारी हैं प्रवाह और बड़े पैमाने पर cytometric पर अपने विशेषज्ञ सलाह के लिए कोर में तकनीक.
Materials
| 12-well plate | Cell Treat | 229512 | |
| Intercalator solution | Fluidigm | 201192A | 125 µM – Ir intercalator solution |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 30525-89-4 | 16 % PFA |
| Strainer cap flow tubes | Fisher/Corning | 352235 | 35 µm pore size |
| Cell sieve | Fisher | 22363547 | 40 μm pore size |
| Cell detatchment solution | CELLnTEC | CnT-ACCUTASE-100 | Accutase |
| Iodine Solution | ThermoFisher/Purdue | 67618-151-17 | Betadine 7.5%-iodine surgical scrub |
| Barcode permeabilization buffer | Fluidigm | 201060 | Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit |
| Barcodes | Fluidigm | 201060 | Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit |
| pH strips | EMD | 9590 | colorpHast |
| DMEM | Hyclone | SH30022.01 | Dulbecco’s Modified Eagle Media |
| Fine forceps | Dumont & Fils | 0109-5-PO | Dumostar #5 |
| Curved precision forceps | Dumont & Fils | 0109-7-PO | Dumostar #7 |
| Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | EQ Four Element Calibration Beads |
| HBSS | Gibco | 14175-095 | Hank's Balanced Salt Solution |
| Water | Fisher | SH30538.03 | Hyclone Molecular Biology grade water |
| Iododeoxyuridine | Sigma | I7125 | IdU |
| Cryo vials | ThermoFisher | 366656PK | internal thread |
| Cell Staining buffer | Fluidigm | 201068 | Maxpar Cell Staining buffer |
| Fix & Perm buffer | Fluidigm | 201067 | Maxpar Fix & Perm buffer |
| Fix I buffer | Fluidigm | 201065 | Maxpar Fix I buffer |
| Phosphate buffered saline | Rockland | MB-008 | Metal free 10x PBS |
| isopropanol-freezing container | ThermoFisher | 5100-0001 | Mr.Frosty |
| Sodium hydroxide | Fisher | BP359-500 | NaOH |
| Petri dish | Kord-Valmark | 2900 | Supplied by Genesee 32-107 |
| 15 mL conical | Olympus/Genesee | 28-101 | |
| 50 mL conical | Olympus/Genesee | 28-106 | |
| 6-well plate | Cell Treat | 229506 | |
| Cisplatin | Sigma | 479306 | |
| Dispase II | Sigma/Roche | 4942078001 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Hydrochloric acid | Fisher | A144-212 | |
| Nuclear Antigen Staining permeabilization buffer | Fluidigm | 201063 | |
| Nuclear Antigen Staining buffer | Fluidigm | 201063 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Tuberculin syringe | BD | 309626 | |
| Type IV Collagenase | Worthington Bioscience | CLSS-4 |
References
- Guzinska-Ustymowicz, K., Pryczynicz, A., Kemona, A., Czyzewska, J. Correlation between proliferation markers: PCNA, Ki-67, MCM-2 and antiapoptotic protein Bcl-2 in colorectal cancer. Anticancer Research. 29 (8), 3049-3052 (2009).
- Ladstein, R. G., Bachmann, I. M., Straume, O., Akslen, L. A. Ki-67 expression is superior to mitotic count and novel proliferation markers PHH3, MCM4 and mitosin as a prognostic factor in thick cutaneous melanoma. BioMedCentral Cancer. 10, 140 (2010).
- Ryan, W. K. Activation of S6 signaling is associated with cell survival and multinucleation in hyperplastic skin after epidermal loss of AURORA-A Kinase. Cell Death & Differentiation. , (2018).
- Magaud, J. P. Double immunocytochemical labeling of cell and tissue samples with monoclonal anti-bromodeoxyuridine. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 37 (10), 1517-1527 (1989).
- Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).
- Toth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Kraemer, P. M., Petersen, D. F., Van Dilla, M. A. DNA constancy in heteroploidy and the stem line theory of tumors. Science. 174 (4010), 714-717 (1971).
- Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).
- Bandura, D. R. Mass cytometry: technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).
- Bjornson, Z. B., Nolan, G. P., Fantl, W. J. Single-cell mass cytometry for analysis of immune system functional states. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 484-494 (2013).
- Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle. Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).
- Brodie, T. M., Tosevski, V. High-Dimensional Single-Cell Analysis with Mass Cytometry. Current Protocols in Immunology. 118, 5.11.11-15.11.25 (2017).
- McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. Journal of Visual Experimentation. 122, (2017).
- Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nature Protocols. 3 (5), 799-810 (2008).
- Zhang, L. Defects in Stratum Corneum Desquamation Are the Predominant Effect of Impaired ABCA12 Function in a Novel Mouse Model of Harlequin Ichthyosis. PLoS One. 11 (8), e0161465 (2016).
- Zunder, E. R. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).
- Sumatoh, H. R., Teng, K. W., Cheng, Y., Newell, E. W. Optimization of mass cytometry sample cryopreservation after staining. Cytometry A. 91 (1), 48-61 (2017).
- Finck, R. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).
- Trowbridge, I. S., Thomas, M. L. CD45: an emerging role as a protein tyrosine phosphatase required for lymphocyte activation and development. Annual Review of Immunology. 12, 85-116 (1994).
- Torchia, E. C., Boyd, K., Rehg, J. E., Qu, C., Baker, S. J. EWS/FLI-1 induces rapid onset of myeloid/erythroid leukemia in mice. Molecular and Cellular Biology. 27 (22), 7918-7934 (2007).
- Liu, Z. A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue. Journal of Visual Experimentation. (138), (2018).
- Jensen, K. B., Driskell, R. R., Watt, F. M. Assaying proliferation and differentiation capacity of stem cells using disaggregated adult mouse epidermis. Nature Protocols. 5 (5), 898-911 (2010).
- Germain, L. Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin. Burns. 19 (2), 99-104 (1993).
- Fluhr, J. W. Impact of anatomical location on barrier recovery, surface pH and stratum corneum hydration after acute barrier disruption. British Journal of Dermatology. 146 (5), 770-776 (2002).
- Webb, A., Li, A., Kaur, P. Location and phenotype of human adult keratinocyte stem cells of the skin. Differentiation. 72 (8), 387-395 (2004).
- Torchia, E. C., et al. A genetic variant of Aurora kinase A promotes genomic instability leading to highly malignant skin tumors. Cancer Research. 69 (18), 7207-7215 (2009).
- Frei, A. P. Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells. Nature Methods. 13 (3), 269-275 (2016).
