Isolação e mancha de keratinocytes da pele do rato para a análise específica do ciclo de pilha da expressão celular da proteína pela citometria maciça
Summary
Este protocolo descreve como isolar os queratinócitos da pele dos modelos do rato, manchar com os anticorpos metal-etiquetados, e analisar pilhas manchadas pela citometria maciça a fim examinar o teste padrão da expressão das proteínas do interesse nas fases diferentes do ciclo de pilha.
Abstract
O objetivo deste protocolo é detectar e quantificar mudanças da expressão da proteína em uma maneira ciclo-dependente da pilha usando únicas pilhas isoladas da epiderme da pele do rato. Há sete etapas importantes: separação da epiderme da derme, digestão da epiderme, coloração das populações de células epidérmicas com cisplatina, amostra de Barcoding, coloração com anticorpos marcados com metal para marcadores de ciclo celular e proteínas de interesse, deteção de anticorpos metal-etiquetados pela citometria maciça, e a análise da expressão nas várias fases do ciclo de pilha. A vantagem desta aproximação sobre métodos histológicos é o potencial para ensaiar o teste padrão da expressão de > 40 marcadores diferentes em uma única pilha em fases diferentes do ciclo da pilha. Essa abordagem também permite a análise de correlação multivariada da expressão protéica que é mais quantificável do que os métodos histológicos/de imagem. A desvantagem deste protocolo é que uma suspensão de células individuais é necessária, o que resulta na perda de informações de localização fornecidas pela coloração de seções de tecido. Essa abordagem também pode requerer a inclusão de marcadores adicionais para identificar diferentes tipos de células em suspensões de células brutas. A aplicação deste protocolo é evidente na análise de modelos hyperplastic da doença de pele. Além disso, este protocolo pode ser adaptado para a análise do subtipo específico de pilhas (por exemplo, pilhas de haste) pela adição de anticorpos linhagem-específicos. Este protocolo também pode ser adaptado para a análise de células cutâneas em outras espécies experimentais.
Introduction
A correlação da expressão gênica com os estágios do ciclo celular continua sendo um desafio na análise de modelos animais de doenças hiperplásicas como o câncer. Parte deste desafio é a codetecção de proteínas de interesse (POI) com marcadores de proliferação. Células proliferativas podem ser encontradas em várias fases do ciclo celular, incluindo G1, S, G2 e M. o 67 é um dos marcadores mais comumente usados de proliferação e é expressa em todas as fases do ciclo celular. Tem sido amplamente utilizado na análise dos tecidos humanos e do camundongo1,2,3. No entanto, como outros marcadores de proliferação geral, o 67 não discernir as fases individuais do ciclo celular. Uma aproximação mais precisa usa a incorporação de análogos do nucleotide do timidina como bromodeoxyuridine (BrdU) em pilhas que estão replicando ativamente seu genoma (isto é, S-fase)4,5. Uma desvantagem para o uso de análogos de nucleotídeo é a necessidade de administrá-los a animais vivos horas antes da análise. O 67 e o BrdU são comumente detectados em seções de tecidos fixos pelo uso de anticorpos. Uma vantagem desta aproximação é que a posição dos POIs pode ser verificada dentro da arquitetura do tecido (por exemplo, a camada básica de epiderme da pele). Esta aproximação igualmente não exige a dissociação do tecido que pode conduzir às mudanças na expressão de Gene. Uma desvantagem é que a fixação do tecido ou o processamento do tecido para OCT congelado ou corte de parafina podem oclusos alvos de anticorpos (ou seja, antígenos). A recuperação de antígenos normalmente requer digestão de calor ou tecido. A quantificação das intensidades de coloração também pode ser desafiadora. Isto é devido às variações na mancha, na espessura de seção, na deteção do sinal, e no viés do experimentador. Além disso, um número limitado de marcadores pode ser detectado simultaneamente na maioria das configurações de laboratório típicas. No entanto, novas abordagens de coloração multiplex prometem superar essas limitações; exemplos são citometria de massa por imagem e amplificação de sinaldetiramida6,7.
A citometria de fluxo é outra tecnologia poderosa para detectar células proliferantes. Permite a deteção multiplex dos marcadores nas mesmas pilhas mas exige a dissociação do tecido para a maioria de tipos não-hematopoietic da pilha. A análise de células proliferantes é feita rotineiramente pelo uso de corantes que ligam o DNA (por exemplo, iodeto de Propiídio (PI))8. A citometria de fluxo também permite uma determinação mais precisa das fases do ciclo celular quando associada à detecção da incorporação de BrdU9. Embora uma abordagem poderosa, a citometria de fluxo de BrdU/PI tem suas desvantagens. Não é possível resolver as fases G2/M e G0/G1 sem a inclusão de anticorpos específicos da fase. No entanto, o número de anticorpos que podem ser utilizados é limitado por autofluorescência celular, derrame espectral de emissões de fluoróforo, e o uso de controles de compensação. Essa limitação a marca mais desafiadora e trabalhosa para codetectar a expressão de marcadores de ciclo celular com pis. Uma aproximação mais facile é usar a citometria maciça10,11. Esta tecnologia usa anticorpos conjugados metálicos que têm um espectro de detecção mais estreito. Uma vez que as pilhas são manchadas com os anticorpos metal-etiquetados, são vaporizado, e os metais detectados pela espectrometria maciça do tempo–vôo da citometria (CyTOF). Devido a essas propriedades, a citometria de massa possibilita a detecção multiplex de > 40 marcadores diferentes utilizando as plataformas existentes10,11. Além disso, é possível amostras de código de barras com metais que resultam na poupança de anticorpos preciosos, reduzindo a variabilidade da amostra para a amostra de coloração. Por outro lado, a citometria de massas tem várias desvantagens. Há um número limitado de anticorpos metal-etiquetados comercialmente disponíveis para as pilhas não derivadas do sangue. A quantificação do conteúdo de DNA é menos sensível em comparação com o uso de corantes fluorescentes de DNA e a citometria de massa tem uma faixa dinâmica reduzida de detecção de sinal em comparação com a citometria de fluxo de fluorescência.
O protocolo descrito aqui foi projetado analisar a dinâmica do ciclo de pilha dos queratinócitos recentemente isolados (KCS) da pele do rato e caracterizar a expressão específica da proteína do ciclo de pilha nestas pilhas usando a citometria maciça. Este protocolo também pode ser usado com células cultivadas ou adaptado para outros tipos de células.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo esboçado neste papel pode ser terminado em aproximadamente 8 h. O resultado final é uma suspensão de células enriquecidas em KCs que podem ser analisadas para a expressão protéica de forma dependente do ciclo celular. Vários estudos anteriores têm delineado métodos para isolar KCS da pele humana e do rato16,25. Esses estudos também incluem protocolos para o isolamento de KCs para citometria de fluxo26. Entretanto, um …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O apoio para este trabalho veio do departamento de Dermatologia, o centro de Gates para medicina regenerativa da Universidade do Colorado e da Universidade do Colorado (UC) pele Disease Center morfologia e núcleos de fenotipagem (NIAMS p30 AR057212). Os autores reconhecem o recurso compartilhado da citometria de fluxo do centro do cancro UC e a concessão da sustentação (NCI p30 CA046934) para a operação do citômetro maciço e são gratos para Karen Helm e Christine Childs no núcleo para seu conselho perito no fluxo e na massa cytometric do Técnicas.
Materials
| 12-well plate | Cell Treat | 229512 | |
| Intercalator solution | Fluidigm | 201192A | 125 µM – Ir intercalator solution |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 30525-89-4 | 16 % PFA |
| Strainer cap flow tubes | Fisher/Corning | 352235 | 35 µm pore size |
| Cell sieve | Fisher | 22363547 | 40 μm pore size |
| Cell detatchment solution | CELLnTEC | CnT-ACCUTASE-100 | Accutase |
| Iodine Solution | ThermoFisher/Purdue | 67618-151-17 | Betadine 7.5%-iodine surgical scrub |
| Barcode permeabilization buffer | Fluidigm | 201060 | Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit |
| Barcodes | Fluidigm | 201060 | Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit |
| pH strips | EMD | 9590 | colorpHast |
| DMEM | Hyclone | SH30022.01 | Dulbecco’s Modified Eagle Media |
| Fine forceps | Dumont & Fils | 0109-5-PO | Dumostar #5 |
| Curved precision forceps | Dumont & Fils | 0109-7-PO | Dumostar #7 |
| Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | EQ Four Element Calibration Beads |
| HBSS | Gibco | 14175-095 | Hank's Balanced Salt Solution |
| Water | Fisher | SH30538.03 | Hyclone Molecular Biology grade water |
| Iododeoxyuridine | Sigma | I7125 | IdU |
| Cryo vials | ThermoFisher | 366656PK | internal thread |
| Cell Staining buffer | Fluidigm | 201068 | Maxpar Cell Staining buffer |
| Fix & Perm buffer | Fluidigm | 201067 | Maxpar Fix & Perm buffer |
| Fix I buffer | Fluidigm | 201065 | Maxpar Fix I buffer |
| Phosphate buffered saline | Rockland | MB-008 | Metal free 10x PBS |
| isopropanol-freezing container | ThermoFisher | 5100-0001 | Mr.Frosty |
| Sodium hydroxide | Fisher | BP359-500 | NaOH |
| Petri dish | Kord-Valmark | 2900 | Supplied by Genesee 32-107 |
| 15 mL conical | Olympus/Genesee | 28-101 | |
| 50 mL conical | Olympus/Genesee | 28-106 | |
| 6-well plate | Cell Treat | 229506 | |
| Cisplatin | Sigma | 479306 | |
| Dispase II | Sigma/Roche | 4942078001 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Hydrochloric acid | Fisher | A144-212 | |
| Nuclear Antigen Staining permeabilization buffer | Fluidigm | 201063 | |
| Nuclear Antigen Staining buffer | Fluidigm | 201063 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Tuberculin syringe | BD | 309626 | |
| Type IV Collagenase | Worthington Bioscience | CLSS-4 |
References
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