질량 세포 측정에 의한 세포 단백질 발현의 세포 주기 특이적 분석을 위한 마우스 피부 각질 세포의 분리 및 염색
Summary
이 프로토콜은 마우스 모델에서 피부 각질을 분리하고, 금속 태그가 달린 항체로 염색하고, 다른 세포 주기 단계에서 관심 있는 단백질의 발현 패턴을 프로파일화하기 위해 질량 세포 측정에 의해 염색된 세포를 분석하는 방법을 설명합니다.
Abstract
이 프로토콜의 목표는 마우스 피부의 표피로부터 단리된 단일 세포를 사용하여 세포 주기 의존적 방식으로 단백질 발현 변화를 검출하고 정량화하는 것이다. 7개의 중요한 단계가 있습니다: 진피에서 표피의 분리, 표피의 소화, 시스플라틴을 가진 표피 세포 집단의 염색, 견본 바코드, 세포 주기 마커 및 단백질을 위한 금속 태그가 붙은 항체를 가진 염색 관심, 질량 세포 분석에 의한 금속 태그 항체의 검출, 및 다양한 세포 주기 상에서발현의 분석. 조직학적 방법에 대한 이러한 접근법의 장점은 세포 주기의 상이한 단계에서 단일 세포에서 >40의 발현 패턴을 분석할 수 있는 가능성이다. 이 접근은 또한 조직학/화상 진찰 방법 보다는 더 정량화할 수 있는 단백질 발현의 다변량 상관 성 분석을 허용합니다. 이 프로토콜의 단점은 단일 세포의 현탁액이 필요하며, 이는 조직 섹션의 염색에 의해 제공되는 위치 정보의 손실을 초래한다는 것입니다. 이 접근법은 또한 조세포 현탁액에서 상이한 세포 유형을 식별하기 위해 추가 마커의 포함을 요구할 수 있다. 이 프로토콜의 적용은 과형성 피부 질환 모델의 분석에서 분명합니다. 더욱이, 이 프로토콜은 계보 특이적 항체의 첨가에 의해 특정 하위 유형의 세포(예를 들어, 줄기 세포)의 분석을 위해 적응될 수 있다. 이 프로토콜은 또한 다른 실험 종에서 피부 세포의 분석을 위해 적응될 수 있다.
Introduction
세포 주기 단계와 유전자 발현의 상관관계는 암과 같은 과형성 질환의 동물 모델 분석에 여전히 도전과제로 남아 있다. 이 도전의 일부는 증식의 마커를 가진 관심있는 단백질 (POI)의 공동 검출입니다. 증식 세포는 G1, S, G2 및 M. Ki67을 포함한 다양한 세포 주기 단계에서 발견될 수 있으며, 가장 일반적으로 사용되는 증식 마커 중 하나이며 세포 주기의 모든 단계에서 발현된다. 그것은 광범위하게 인간과 마우스 조직 모두의 분석에사용되어왔다 1,2,3. 그러나, 다른 일반적인 증식 마커 처럼, Ki67 개별 세포 주기 단계를 분별 하지 않습니다. 보다 정밀한 접근법은 브로모데독시우리딘(BrdU)과 같은 티미딘 뉴클레오티드 유사체를 게놈(즉, S상)을적극적으로 복제하는 세포에 4,5를사용합니다. 뉴클레오티드 유사체의 사용에 대한 한 가지 단점은 분석 하기 전에 살아있는 동물에 그들을 관리 하는 필요. Ki67 및 BrdU는 항체의 사용에 의해 고정된 조직 단면도에서 일반적으로 검출됩니다. 이 접근법의 한 가지 장점은 POI의 위치가 조직 아키텍처(예를 들어, 피부 표피의 기저층) 내에서 확인될 수 있다는 것입니다. 이 접근은 또한 유전자 발현에 있는 변경으로 이끌어 낼 수 있는 조직 해리를 요구하지 않습니다. 한 가지 단점은 OCT 동결 또는 파라핀 절편을 위한 조직의 조직 고정 또는 처리가 항체 표적(즉, 항원)을 폐색시킬 수 있다는 것이다. 항원의 검색은 전형적으로 열 또는 조직 소화를 요구합니다. 염색 강도의 정량화도 어려울 수 있습니다. 이는 염색, 단면 두께, 신호 감지 및 실험자 바이어스의 변화에 기인합니다. 또한 대부분의 일반적인 실험실 설정에서 제한된 수의 마커를 동시에 감지할 수 있습니다. 그러나, 새로운 멀티플렉스 염색 접근 방식은 이러한 한계를 극복할 것을 약속합니다. 예는 이미징 질량 세포 측정 및 티라 미드신호 증폭 6,7.
유세포측정은 증식 세포를 검출하는 또 다른 강력한 기술입니다. 그것은 동일 세포에 있는 마커의 다중 검출을 허용합니다 그러나 대부분의 비 조혈 세포 모형을 위한 조직 해리를 요구합니다. 증식 세포의 분석은 DNA를 결합하는 염료(예를 들어, 프로피듐 요오드화물(PI))의사용에 의해 일상적으로 수행된다 8. 유세포측정은 또한 BrdU 법인9의검출과 결합될 때 세포 주기 단계의 보다 정확한 측정을 허용한다. 강력한 접근 방식이지만 BrdU/PI 유동 세포측정은 단점이 있습니다. 위상 특이적 항체를 포함하지 않고는 G2/M 및 G0/G1 단계를 해결할 수 없습니다. 그러나, 사용될 수 있는 항체의 수는 세포 자가형광, 불소 방출의 스펙트럼 유출, 및 보상 제어의 사용에 의해 제한된다. 이 한계는 POI를 가진 세포 주기 마커의 표현을 공동 검출하기 위하여 더 도전적이고 힘든 표시합니다. 더 허구적인 접근법은 질량 세포 분석10,11을사용하는 것입니다. 이 기술은 더 좁은 검출 스펙트럼을 가진 금속 공액 항체를 사용합니다. 일단 세포가 금속 태그가 달린 항체로 염색되면 기화되고 세포 분석 시간(CyTOF) 질량 분석법에 의해 검출된 금속이 기화됩니다. 이러한 특성으로 인해 질량 세포 분석은 기존 플랫폼10,11을사용하여 >40 다른 마커의 멀티플렉스 검출을 가능하게 한다. 또한, 귀중한 항체를 절감하는 한편 시료 간 염색 가변성을 줄이는 금속으로 시료를 바코드화할 수 있습니다. 다른 한편으로는, 질량 세포측정은 몇몇 단점이 있습니다. 비혈액 유래 세포에 대한 시판되는 금속 태그항체의 수가 제한되어 있다. 형광 DNA 염료 및 질량 세포측정의 사용에 비해 DNA 함량의 정량화는 형광 유동 세포측정에 비해 신호 검출의 감소된 동적 범위를 가지고 있다.
여기에서 기술된 프로토콜은 마우스 피부로부터 새로 단리된 각질세포(KC)로부터 세포 주기 역학을 분석하고 대량 세포분석기를 사용하여 이들 세포에서 세포 주기 특정 단백질 발현을 특성화하도록 설계되었습니다. 이 프로토콜은 또한 배양된 세포와 함께 사용되거나 다른 세포 유형에 적응될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 백서에 설명된 프로토콜은 약 8시간 안에 완료할 수 있습니다. 최종 결과는 세포 주기 의존적 방식으로 단백질 발현을 위해 분석될 수 있는 KC에서 농축된 세포의 현탁액이다. 몇몇 이전 연구 결과는 인간과 마우스 피부에서 PC를 격리하는 방법을 설명했습니다16,25. 이러한 연구는 또한 유세포분석26에 대한 CS의격리를 위한 프로토콜?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품에 대한 지원은 피부과, 콜로라도 대학과 콜로라도 대학의 재생 의학을위한 게이츠 센터에서 왔다 (UC) 피부 질환 센터 형태학 및 표현형 코어 (NIAMS P30 AR057212). 저자는 UC 암 센터 유동 세포 측정 공유 자원 및 지원 보조금 (NCI P30 CA046934)을 인정질량 세포계의 작동에 대한 및 흐름과 질량 세포 측정에 대한 전문가의 조언에 대한 핵심 카렌 헬름과 크리스틴 어린이에 대한 감사 기술을.
Materials
| 12-well plate | Cell Treat | 229512 | |
| Intercalator solution | Fluidigm | 201192A | 125 µM – Ir intercalator solution |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 30525-89-4 | 16 % PFA |
| Strainer cap flow tubes | Fisher/Corning | 352235 | 35 µm pore size |
| Cell sieve | Fisher | 22363547 | 40 μm pore size |
| Cell detatchment solution | CELLnTEC | CnT-ACCUTASE-100 | Accutase |
| Iodine Solution | ThermoFisher/Purdue | 67618-151-17 | Betadine 7.5%-iodine surgical scrub |
| Barcode permeabilization buffer | Fluidigm | 201060 | Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit |
| Barcodes | Fluidigm | 201060 | Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit |
| pH strips | EMD | 9590 | colorpHast |
| DMEM | Hyclone | SH30022.01 | Dulbecco’s Modified Eagle Media |
| Fine forceps | Dumont & Fils | 0109-5-PO | Dumostar #5 |
| Curved precision forceps | Dumont & Fils | 0109-7-PO | Dumostar #7 |
| Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | EQ Four Element Calibration Beads |
| HBSS | Gibco | 14175-095 | Hank's Balanced Salt Solution |
| Water | Fisher | SH30538.03 | Hyclone Molecular Biology grade water |
| Iododeoxyuridine | Sigma | I7125 | IdU |
| Cryo vials | ThermoFisher | 366656PK | internal thread |
| Cell Staining buffer | Fluidigm | 201068 | Maxpar Cell Staining buffer |
| Fix & Perm buffer | Fluidigm | 201067 | Maxpar Fix & Perm buffer |
| Fix I buffer | Fluidigm | 201065 | Maxpar Fix I buffer |
| Phosphate buffered saline | Rockland | MB-008 | Metal free 10x PBS |
| isopropanol-freezing container | ThermoFisher | 5100-0001 | Mr.Frosty |
| Sodium hydroxide | Fisher | BP359-500 | NaOH |
| Petri dish | Kord-Valmark | 2900 | Supplied by Genesee 32-107 |
| 15 mL conical | Olympus/Genesee | 28-101 | |
| 50 mL conical | Olympus/Genesee | 28-106 | |
| 6-well plate | Cell Treat | 229506 | |
| Cisplatin | Sigma | 479306 | |
| Dispase II | Sigma/Roche | 4942078001 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Hydrochloric acid | Fisher | A144-212 | |
| Nuclear Antigen Staining permeabilization buffer | Fluidigm | 201063 | |
| Nuclear Antigen Staining buffer | Fluidigm | 201063 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Tuberculin syringe | BD | 309626 | |
| Type IV Collagenase | Worthington Bioscience | CLSS-4 |
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