이 프로토콜은 마우스 모델에서 피부 각질을 분리하고, 금속 태그가 달린 항체로 염색하고, 다른 세포 주기 단계에서 관심 있는 단백질의 발현 패턴을 프로파일화하기 위해 질량 세포 측정에 의해 염색된 세포를 분석하는 방법을 설명합니다.
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방법 논문
질량 세포 측정에 의한 세포 단백질 발현의 세포 주기 특이적 분석을 위한 마우스 피부 각질 세포의 분리 및 염색
이 논문에서
요약
초록
이 프로토콜의 목표는 마우스 피부의 표피로부터 단리된 단일 세포를 사용하여 세포 주기 의존적 방식으로 단백질 발현 변화를 검출하고 정량화하는 것이다. 7개의 중요한 단계가 있습니다: 진피에서 표피의 분리, 표피의 소화, 시스플라틴을 가진 표피 세포 집단의 염색, 견본 바코드, 세포 주기 마커 및 단백질을 위한 금속 태그가 붙은 항체를 가진 염색 관심, 질량 세포 분석에 의한 금속 태그 항체의 검출, 및 다양한 세포 주기 상에서발현의 분석. 조직학적 방법에 대한 이러한 접근법의 장점은 세포 주기의 상이한 단계에서 단일 세포에서 >40의 발현 패턴을 분석할 수 있는 가능성이다. 이 접근은 또한 조직학/화상 진찰 방법 보다는 더 정량화할 수 있는 단백질 발현의 다변량 상관 성 분석을 허용합니다. 이 프로토콜의 단점은 단일 세포의 현탁액이 필요하며, 이는 조직 섹션의 염색에 의해 제공되는 위치 정보의 손실을 초래한다는 것입니다. 이 접근법은 또한 조세포 현탁액에서 상이한 세포 유형을 식별하기 위해 추가 마커의 포함을 요구할 수 있다. 이 프로토콜의 적용은 과형성 피부 질환 모델의 분석에서 분명합니다. 더욱이, 이 프로토콜은 계보 특이적 항체의 첨가에 의해 특정 하위 유형의 세포(예를 들어, 줄기 세포)의 분석을 위해 적응될 수 있다. 이 프로토콜은 또한 다른 실험 종에서 피부 세포의 분석을 위해 적응될 수 있다.
서론
세포 주기 단계와 유전자 발현의 상관관계는 암과 같은 과형성 질환의 동물 모델 분석에 여전히 도전과제로 남아 있다. 이 도전의 일부는 증식의 마커를 가진 관심있는 단백질 (POI)의 공동 검출입니다. 증식 세포는 G1, S, G2 및 M. Ki67을 포함한 다양한 세포 주기 단계에서 발견될 수 있으며, 가장 일반적으로 사용되는 증식 마커 중 하나이며 세포 주기의 모든 단계에서 발현된다. 그것은 광범위하게 인간과 마우스 조직 모두의 분석에사용되어왔다 1,2,3. 그러나, 다른 일반적인 증식 마커 처럼, Ki67 개별 세포 주기 단계를 분별 하지 않습니다. 보다 정밀한 접근법은 브로모데독시우리딘(BrdU)과 같은 티미딘 뉴클레오티드 유사체를 게놈(즉, S상)을적극적으로 복제하는 세포에 4,5를사용합니다. 뉴클레오티드 유사체의 사용에 대한 한 가지 단점은 분석 하기 전에 살아있는 동물에 그들을 관리 하는 필요. Ki67 및 BrdU는 항체의 사용에 의해 고정된 조직 단면도에서 일반적으로 검출됩니다. 이 접근법의 한 가지 장점은 ....
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프로토콜
콜로라도 안슈츠 대학 의과 대학' 기관 동물 관리 및 사용 위원회는이 프로토콜에 설명 된 동물 실험을 승인.
1. 준비
- 금속 태그가 지정된 항체 패널을 디자인합니다. 무료 온라인 패널 설계 소프트웨어(12)를 사용하고 127개의IododeoxyUridine(IdU), 164Dy(Dysprosium) 라벨이 부착된 안티 CCNB1(CYCLIN B1), 175Lu(루테리움) 인포(p)-HISTONEH3 Ser28(pHH3) 및 150을 포함합니다. Nd (네오디뮴)-pRETINOBLASTOMA 단백질Ser807/811 (pRB)13. 그들의 채널신호(14)에서겹치지 않는 추가금속 태그가 달린 항체를 추가한다.
- IdU 재고 솔루션을 준비합니다. IdU 분말을 60°C에서 0.1 N NaOH에서 10 mg/mL로 용해시면 됩니다. Aliquot IdU 스톡 솔루션을 미세 원심 분리튜브에 넣고 -20°C에서 동결하여 장기 보관합니다.
- 사용하기 직전에 12 N ....
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결과
표 1은 비병리학적 조건 하에서 성인마우스 귀 및 신생아 피부로부터의 예상 세포 수율 및 생존율을 나타낸다. 이 표에는 혼합 C57/126 배경에서 동물의 대표 데이터도 표시됩니다. 그것은 다른 균주의 피부가 유사한 세포 수율과 부채를 초래할 것으로 예상된다. 대략적인 수율은 피부의 표면적에 의존하며 신생아 피부가 더 많은 수의 세포를 필요로 하는 실험에 더 나은 선택이 될 것임을 나타냅니다(표 1). 낮은 수율 또는 감소된 생존율(&50%) 피부 무결성을 감소 또는 세포 죽음의 유도 소화 또는 실험 조건 문제를 나타냅니다. 적절한 매체 및 보충제로 세포를 배양하면 KC 제제의 품질을 평가하는 데 도움이 될 수있다 17.
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토론
이 백서에 설명된 프로토콜은 약 8시간 안에 완료할 수 있습니다. 최종 결과는 세포 주기 의존적 방식으로 단백질 발현을 위해 분석될 수 있는 KC에서 농축된 세포의 현탁액이다. 몇몇 이전 연구 결과는 인간과 마우스 피부에서 PC를 격리하는 방법을 설명했습니다16,25. 이러한 연구는 또한 유세포분석26에 대한 CS의격리를 위한 프로토콜을 포함한다. 그러나, 상세한 프로토콜은 질량 세포 측정을 사용하여 단백질 발현 및 세포 주기 역학의 분석과 KC의 분리를 결합하는 이전에 기술되지 않았습니다.
이 프로토콜에서 고품질 결과를 얻는 가장 큰 장애물은 사용되는 라이브 셀의 품질입니다. 문헌에서, 표피/진피 분리에 대한 제안된 조건 및 효소는 크게 변화한다16,
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
이 작품에 대한 지원은 피부과, 콜로라도 대학과 콜로라도 대학의 재생 의학을위한 게이츠 센터에서 왔다 (UC) 피부 질환 센터 형태학 및 표현형 코어 (NIAMS P30 AR057212). 저자는 UC 암 센터 유동 세포 측정 공유 자원 및 지원 보조금 (NCI P30 CA046934)을 인정질량 세포계의 작동에 대한 및 흐름과 질량 세포 측정에 대한 전문가의 조언에 대한 핵심 카렌 헬름과 크리스틴 어린이에 대한 감사 기술을.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 12웰 플레이트 | Cell Treat | 229512 | |
| Intercalator 솔루션 | Fluidigm | 201192A | 125 µ M - Ir 인터칼레이터 용액 |
| 파라포름알데히드 | 전자 현미경 과학 | 30525-89-4 | 16 % PFA |
| 스트레이너 캡 플로우 튜브 | Fisher/Corning | 352235 | 35 µ M 모공 크기 |
| 세포체 | Fisher | 22363547 | 40 μ M 모공 크기 |
| 세포 제거 용액 | CELLnTEC | CnT-ACCUTASE-100 | Accutase |
| 요오드 용액 | ThermoFisher/Purdue | 67618-151-17 | Betadine 7.5%-iodine surgical scrub |
| 바코드 투과화 완충액; | Fluidigm | 201060 | Cell-ID 20-Plex Pd 바코드 키트 |
| 바코드 | Fluidigm | 201060 | Cell-ID 20-Plex Pd 바코드 키트 |
| pH 스트립 | EMD | 9590 | colorpHast |
| DMEM | Hyclone | SH30022.01 | Dulbecco' s Modified Eagle Media |
| 파인 펜치 | Dumont & Fils | 0109-5-PO | Dumostar #5 |
| 곡선 정밀 집게 | Dumont & Fils | 0109-7-PO | Dumostar #7 |
| 보정 비드 | Fluidigm 201078 | EQ Four Element 보정 비드 | |
| HBSS | Gibco | 14175-095 | Hank's Balanced Salt Solution |
| Water | Fisher | SH30538.03 | Hyclone 분자 생물학 등급 |
| 물 요오도데옥시우리딘 | Sigma | I7125 | IdU |
| 극저온 바이알 | ThermoFisher | 366656PK | 내부 스레드 |
| 셀 염색 완충액 | Fluidigm | 201068 | Maxpar 세포 염색 완충액 |
| Fix & 펌 버퍼 | Fluidigm | 201067 | Maxpar Fix & 펌 버퍼 |
| Fix I 버퍼 | Fluidigm | 201065 | Maxpar Fix I 버퍼 |
| 인산염 버퍼 식염수 | Rockland | MB-008 | 금속 프리 10x PBS |
| 이소프로판올 냉동 용기 | ThermoFisher | 5100-0001 | Mr.Frosty |
| 수산화나트륨 | Fisher | BP359-500 | NaOH |
| 페트리 접시 | Kord-Valmark | 2900 | Genesee 32-107에서 제공 |
| 15mL 원뿔 | Olympus/Genesee | 28-101 | |
| 50mL 원뿔 | Olympus/Genesee | 28-106 | |
| 6웰 플레이트 | 세포 치료 | 제 229506 | |
| 시스플라틴 | Sigma | 479306 | |
| Dispase II | 시그마/Roche | 4942078001 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| 염산 | Fisher | A144-212 | |
| 핵 항원 염색 투과 완충액 | Fluidigm | 201063 | |
| 핵 항원 염색 완충액 | Fluidigm | 201063 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| 투베르쿨린 주사기 | BD | 309626 | |
| IV형 콜라겐분해효소 | 워딩턴 생명과학 | CLSS-4 |
참고문헌
- Guzinska-Ustymowicz, K., Pryczynicz, A., Kemona, A., Czyzewska, J. Correlation between proliferation markers: PCNA, Ki-67, MCM-2 and antiapoptotic protein Bcl-2 in colorectal cancer. Anticancer Research. 29 (8), 3049-3052 (2009).
- Ladstein, R. G., Bachmann, I. M., Straume, O., Akslen, L. A.
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