質量細胞血症による細胞タンパク質発現の細胞周期特異的解析におけるマウス皮膚ケラチノサイトの単離と染色
Summary
このプロトコルは、皮膚ケラチノサイトをマウスモデルから単離し、金属タグ付き抗体で染色し、異なる細胞周期相で目的のタンパク質の発現パターンをプロファイリングするために質量サイトメトリーによって染色された細胞を分析する方法について説明する。
Abstract
このプロトコルの目的は、マウス皮膚の表皮から単一細胞を用いて細胞周期依存的な方法でタンパク質発現変化を検出し、定量することである。7つの重要なステップがあります:真皮からの表皮の分離、表皮の消化、シスプラチンを用した表皮細胞集団の染色、サンプルバーコード、細胞周期マーカーおよびタンパク質に対する金属タグ付き抗体での染色質量サイトメトリーによる金属タグ付き抗体の検出、および様々な細胞周期相における発現の分析に関心を持つ。組織学的方法に対するこのアプローチの利点は、細胞周期の異なる段階で1つの細胞における>40の異なるマーカーの発現パターンをアッセイする可能性である。このアプローチはまた、組織学的/イメージング法よりも定量化可能なタンパク質発現の多変量相関分析を可能にする。このプロトコルの欠点は、単一細胞の懸濁液が必要であり、組織切片の染色によって提供される位置情報の損失をもたらす。このアプローチはまた、粗細胞懸濁液中の異なる細胞型を識別するために追加のマーカーを含めることを必要とする場合もある。このプロトコルの応用は、過形成性皮膚疾患モデルの分析において明らかである。さらに、このプロトコルは、系統特異的抗体の添加によって特定のサブタイプの細胞(例えば、幹細胞)の分析に適合させることができる。このプロトコルはまた、他の実験種における皮膚細胞の分析に適合させることができる。
Introduction
遺伝子発現と細胞周期段階との相関は、がんのような過形成性疾患の動物モデルの解析において依然として課題である。この課題の一部は、増殖のマーカーを用いて目的タンパク質(POI)の共検出です。増殖細胞は、G1、S、G2、およびM.Ki67を含む様々な細胞サイクル段階で見つけることができ、増殖の最も一般的に使用されるマーカーの1つであり、細胞周期のすべての段階で発現される。それはヒトおよびマウス組織の両方の分析で広く使用されている1,2,3.しかし、他の一般的な増殖マーカーと同様に、Ki67は個々の細胞周期相を識別しない。より正確なアプローチは、ブロモデオキシリジン(BrdU)のようなチミジンヌクレオチド類似体を、ゲノムを積極的に複製している細胞(すなわち、S相)4、5を使用する。ヌクレオチド類似体の使用に対する欠点の1つは、分析の数時間前に生きた動物に投与する必要があることです。Ki67およびBrdUは、抗体の使用によって固定組織切片で一般的に検出される。このアプローチの1つの利点は、POIの位置が組織アーキテクチャ(例えば、皮膚表皮の基底層)内で確認できることである。このアプローチはまた、遺伝子発現の変化につながる可能性のある組織解離を必要としない。1つの欠点は、OCT凍結またはパラフィン断面に対する組織の固定または処理が抗体標的(すなわち、抗原)を閉塞しうる点である。抗原の検索は、通常、熱または組織の消化を必要とします。染色強度の定量化も困難な場合があります。これは、染色、断面厚、信号検出、および実験者バイアスの変動によるものです。さらに、限られた数のマーカーは最も典型的な実験室のセットアップで同時に検出することができる。しかし、新しい多重染色アプローチは、これらの制限を克服することを約束します。例は、質量サイトメトリーおよびチラミド信号増幅6、7をイメージングしている。
フローサイトメトリーは、増殖細胞を検出するもう一つの強力な技術です。それは同じ細胞のマーカーの多重検出を可能にするが、ほとんどの非血行細胞タイプのための組織の解離を要求する。増殖細胞の分析は、DNAを結合する染料(例えば、ヨウ化プロピジウム(PI))8を使用することによって日常的に行われる。フローサイトメトリーはまた、BrdU組み込み9の検出と組み合わせた場合、細胞周期相のより正確な決定を可能にする。強力なアプローチですが、BrdU/PIフローサイトメトリーには欠点があります。相特異的抗体を含まないと、G2/MおよびG0/G1相を解決することができません。しかしながら、使用できる抗体の数は、細胞の自己蛍光、蛍光色素放出のスペクトル波及、および補償制御の使用によって制限される。この制限は、POI を使用して細胞サイクル マーカーの発現を共に検出するのがより困難で手間のかかることをマークします。より表面的なアプローチは、質量サイトメトリー10、11を使用することです。この技術は、より狭い検出スペクトルを持つ金属共役抗体を使用しています。細胞が金属タグ付き抗体で染色されると、それらは気化され、細胞メトリー飛行時間(CyTOF)質量分析によって検出された金属。これらの特性により、質量サイトメトリーは、既存のプラットフォーム10、11を使用して>40の異なるマーカーの多重検出を可能にします。さらに、サンプル間染色の変動を低減しながら、貴重な抗体の節約につながる金属でサンプルをバーコードすることが可能です。一方、質量サイトメトリーにはいくつかの欠点がある。非血液由来細胞に対して市販の金属タグ付き抗体の数は限られています。DNA含有量の定量化は、蛍光DNA色素および質量サイトメトリーの使用に比べて感受性が低く、蛍光流細胞メトリーと比較して信号検出のダイナミックレンジが低下している。
ここで説明するプロトコルは、マウスの皮膚から新たに単離されたケラチノサイト(KC)からの細胞周期ダイナミクスを分析し、質量サイトメトリーを用いてこれらの細胞における細胞周期特異的タンパク質発現を特徴付けることを目的とした。このプロトコルは、培養細胞と共に使用することも、他の細胞型に適合させることもできる。
Protocol
Representative Results
Discussion
このホワイト ペーパーで概説されているプロトコルは、約 8 時間で完了できます。その結果、細胞周期依存的な方法でタンパク質発現を分析できる、KCで濃縮された細胞の懸濁液が得られます。いくつかの以前の研究は、ヒトおよびマウスの皮膚からKCを分離する方法を概説している16,25.これらの研究には、フローサイトメトリー26</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究のサポートは、コロラド大学とコロラド大学(UC)皮膚疾患センターの再生医学のためのゲートセンター、皮膚科から来ました (NIAMS P30 AR00 AR057212).著者らは、UCがんセンターフローサイトメトリー共有リソースとサポート助成金(NCI P30 CA046934)を認め、カレン・ヘルムとクリスティン・チャイルズのフローと質量サイトメトリックに関する専門家のアドバイスに感謝しています。技術。
Materials
| 12-well plate | Cell Treat | 229512 | |
| Intercalator solution | Fluidigm | 201192A | 125 µM – Ir intercalator solution |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 30525-89-4 | 16 % PFA |
| Strainer cap flow tubes | Fisher/Corning | 352235 | 35 µm pore size |
| Cell sieve | Fisher | 22363547 | 40 μm pore size |
| Cell detatchment solution | CELLnTEC | CnT-ACCUTASE-100 | Accutase |
| Iodine Solution | ThermoFisher/Purdue | 67618-151-17 | Betadine 7.5%-iodine surgical scrub |
| Barcode permeabilization buffer | Fluidigm | 201060 | Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit |
| Barcodes | Fluidigm | 201060 | Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit |
| pH strips | EMD | 9590 | colorpHast |
| DMEM | Hyclone | SH30022.01 | Dulbecco’s Modified Eagle Media |
| Fine forceps | Dumont & Fils | 0109-5-PO | Dumostar #5 |
| Curved precision forceps | Dumont & Fils | 0109-7-PO | Dumostar #7 |
| Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | EQ Four Element Calibration Beads |
| HBSS | Gibco | 14175-095 | Hank's Balanced Salt Solution |
| Water | Fisher | SH30538.03 | Hyclone Molecular Biology grade water |
| Iododeoxyuridine | Sigma | I7125 | IdU |
| Cryo vials | ThermoFisher | 366656PK | internal thread |
| Cell Staining buffer | Fluidigm | 201068 | Maxpar Cell Staining buffer |
| Fix & Perm buffer | Fluidigm | 201067 | Maxpar Fix & Perm buffer |
| Fix I buffer | Fluidigm | 201065 | Maxpar Fix I buffer |
| Phosphate buffered saline | Rockland | MB-008 | Metal free 10x PBS |
| isopropanol-freezing container | ThermoFisher | 5100-0001 | Mr.Frosty |
| Sodium hydroxide | Fisher | BP359-500 | NaOH |
| Petri dish | Kord-Valmark | 2900 | Supplied by Genesee 32-107 |
| 15 mL conical | Olympus/Genesee | 28-101 | |
| 50 mL conical | Olympus/Genesee | 28-106 | |
| 6-well plate | Cell Treat | 229506 | |
| Cisplatin | Sigma | 479306 | |
| Dispase II | Sigma/Roche | 4942078001 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Hydrochloric acid | Fisher | A144-212 | |
| Nuclear Antigen Staining permeabilization buffer | Fluidigm | 201063 | |
| Nuclear Antigen Staining buffer | Fluidigm | 201063 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Tuberculin syringe | BD | 309626 | |
| Type IV Collagenase | Worthington Bioscience | CLSS-4 |
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