Isolement et coloration des kératinocytes de peau de souris pour l'analyse spécifique de cycle cellulaire de l'expression cellulaire de protéine par cytométrie de masse
Summary
Ce protocole décrit comment isoler les kératinocytes cutanés des modèles de souris, les tacles avec des anticorps marqués en métal, et analyser les cellules tachées par cytométrie de masse afin de profiler le modèle d’expression des protéines d’intérêt dans les différentes phases du cycle cellulaire.
Abstract
L’objectif de ce protocole est de détecter et de quantifier les changements d’expression des protéines d’une manière dépendante du cycle cellulaire à l’aide de cellules individuelles isolées de l’épiderme de la peau de souris. Il y a sept étapes importantes : séparation de l’épiderme du derme, digestion de l’épiderme, coloration des populations épidermiques avec cisplatine, codage à barres d’échantillon, coloration avec des anticorps métalliques marqués pour les marqueurs de cycle cellulaire et les protéines de l’intérêt, la détection d’anticorps marqués par le métal par cytométrie de masse, et l’analyse de l’expression dans les différentes phases du cycle cellulaire. L’avantage de cette approche par rapport aux méthodes histologiques est le potentiel d’analyse du modèle d’expression de marqueurs différents dans une seule cellule à différentes phases du cycle cellulaire. Cette approche permet également l’analyse multivariée de corrélation de l’expression de protéine qui est plus quantifiable que les méthodes histologiques/imaging. L’inconvénient de ce protocole est qu’une suspension des cellules simples est nécessaire, ce qui entraîne la perte de l’information de localisation fournie par la coloration des sections de tissu. Cette approche peut également nécessiter l’inclusion de marqueurs supplémentaires pour identifier différents types de cellules dans les suspensions de cellules brutes. L’application de ce protocole est évidente dans l’analyse des modèles hyperplastiques de maladie de peau. En outre, ce protocole peut être adapté pour l’analyse de sous-types spécifiques de cellules (par exemple, les cellules souches) par l’ajout d’anticorps spécifiques à la lignée. Ce protocole peut également être adapté pour l’analyse des cellules de la peau chez d’autres espèces expérimentales.
Introduction
La corrélation de l’expression génique avec les stades du cycle cellulaire demeure un défi dans l’analyse des modèles animaux de maladies hyperplastiques comme le cancer. Une partie de ce défi est la co-détection des protéines d’intérêt (POI) avec des marqueurs de prolifération. Les cellules proliférantes peuvent être trouvées dans diverses phases de cycle cellulaire comprenant G1, S, G2, et M. Ki67 est l’un des marqueurs les plus couramment utilisés de la prolifération et est exprimée dans toutes les phases du cycle cellulaire. Il a été largement utilisé dans l’analyse des tissus humains et de souris1,2,3. Cependant, comme d’autres marqueurs de prolifération générale, Ki67 ne discerne pas les phases individuelles du cycle cellulaire. Une approche plus précise utilise l’incorporation d’analogues de nucléotide de thymidine comme la bromodeoxyuridine (BrdU) dans des cellules qui reproduisent activement leur génome (c.-à-d. la phase S)4,5. Un inconvénient à l’utilisation des analogues nucléotides est la nécessité de les administrer aux animaux vivants heures avant l’analyse. Ki67 et BrdU sont généralement détectés sur les sections de tissus fixes par l’utilisation d’anticorps. L’un des avantages de cette approche est que l’emplacement des points d’accès peut être déterminé dans l’architecture tissulaire (p. ex., la couche basale de l’épiderme cutané). Cette approche ne nécessite pas non plus de dissociation tissulaire qui peut conduire à des changements dans l’expression des gènes. L’un des inconvénients est que la fixation des tissus ou le traitement du tissu pour la section congelée ou paraffine de l’OCT peut obstruer les cibles des anticorps (c.-à-d. les antigènes). La récupération des antigènes nécessite généralement une digestion thermique ou tissulaire. La quantification des intensités de coloration peut également être difficile. Cela est dû aux variations de la coloration, de l’épaisseur de la section, de la détection du signal et du biais de l’expérimentateur. En outre, un nombre limité de marqueurs peut être détecté simultanément dans la plupart des configurations de laboratoire typiques. Pourtant, de nouvelles approches de coloration multiplex promettent de surmonter ces limites; exemples sont la cytométrie de masse d’imagerie et l’amplification du signal Tyramide6,7.
La cytométrie des flux est une autre technologie puissante pour détecter les cellules proliférantes. Il permet la détection multiplexe des marqueurs dans les mêmes cellules, mais nécessite une dissociation tissulaire pour la plupart des types de cellules non hématopoïétiques. L’analyse des cellules proliférantes est régulièrement effectuée par l’utilisation de colorants qui lient l’ADN (p. ex., Propidium Iodide (PI))8. La cytométrie de flux permet également une détermination plus précise des phases du cycle cellulaire lorsqu’elle est associée à la détection de l’incorporation BrdU9. Bien qu’il s’adresse avec force, la cytométrie du flux BrdU/PI a ses inconvénients. Il n’est pas en mesure de résoudre les phases G2/M et G0/G1 sans l’inclusion d’anticorps spécifiques à la phase. Cependant, le nombre d’anticorps qui peuvent être utilisés est limité par l’autofluorescence cellulaire, les retombées spectrales des émissions de fluorophore et l’utilisation de contrôles de compensation. Cette limitation indique qu’il est plus difficile et laborieux de co-détecter l’expression des marqueurs de cycle cellulaire avec des POI. Une approche plus facile est d’utiliser la cytométrie de masse10,11. Cette technologie utilise des anticorps conjugués métalliques qui ont un spectre de détection plus étroit. Une fois que les cellules sont tachées d’anticorps marqués par le métal, elles sont vaporisées et les métaux détectés par la spectrométrie de masse cytométrie (CyTOF). En raison de ces propriétés, la cytométrie de masse permet la détection multiplexe de marqueurs différents à l’aide de plates-formes existantes10,11. En outre, il est possible de coder à barres des échantillons avec des métaux qui se traduisent par des économies d’anticorps précieux tout en réduisant la variabilité des taches d’échantillon en échantillon. D’autre part, la cytométrie de masse a plusieurs inconvénients. Il existe un nombre limité d’anticorps étiquetés métalliques disponibles dans le commerce pour les cellules non dérivées du sang. La quantification de la teneur en ADN est moins sensible par rapport à l’utilisation de colorants fluorescents de l’ADN et la cytométrie de masse a une plage dynamique réduite de détection de signal par rapport à la cytométrie de flux de fluorescence.
Le protocole décrit ici a été conçu pour analyser la dynamique du cycle cellulaire des kérainocytes nouvellement isolés (KCs) de la peau de souris et caractériser l’expression protéique spécifique au cycle cellulaire dans ces cellules en utilisant la cytométrie de masse. Ce protocole peut également être utilisé avec des cellules cultivées ou adapté à d’autres types de cellules.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit dans ce document peut être complété en environ 8 h. Le résultat final est une suspension des cellules enrichies en KCs qui peuvent être analysés pour l’expression des protéines d’une manière cellulaire dépendante du cycle. Plusieurs études antérieures ont décrit des méthodes pour isoler les KCde la peau humaine et de la souris16,25. Ces études comprennent également des protocoles pour l’isolement des KC spour la cytométrie du …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le département de dermatologie, le Gates Center for Regenerative Medicine de l’Université du Colorado et l’Université du Colorado (UC) Skin Disease Center Morphology and Phenotyping Cores (NIAMS P30 AR057212) ont apporté leur soutien à ce travail. Les auteurs reconnaissent l’UC Cancer Center Flow Cytometry Shared Resource and support grant (NCI P30 CA046934) pour le fonctionnement du cytomètre de masse et sont reconnaissants pour Karen Helm et Christine Childs au cœur de leurs conseils d’experts sur le débit et la masse cytométrique techniques.
Materials
| 12-well plate | Cell Treat | 229512 | |
| Intercalator solution | Fluidigm | 201192A | 125 µM – Ir intercalator solution |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 30525-89-4 | 16 % PFA |
| Strainer cap flow tubes | Fisher/Corning | 352235 | 35 µm pore size |
| Cell sieve | Fisher | 22363547 | 40 μm pore size |
| Cell detatchment solution | CELLnTEC | CnT-ACCUTASE-100 | Accutase |
| Iodine Solution | ThermoFisher/Purdue | 67618-151-17 | Betadine 7.5%-iodine surgical scrub |
| Barcode permeabilization buffer | Fluidigm | 201060 | Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit |
| Barcodes | Fluidigm | 201060 | Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit |
| pH strips | EMD | 9590 | colorpHast |
| DMEM | Hyclone | SH30022.01 | Dulbecco’s Modified Eagle Media |
| Fine forceps | Dumont & Fils | 0109-5-PO | Dumostar #5 |
| Curved precision forceps | Dumont & Fils | 0109-7-PO | Dumostar #7 |
| Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | EQ Four Element Calibration Beads |
| HBSS | Gibco | 14175-095 | Hank's Balanced Salt Solution |
| Water | Fisher | SH30538.03 | Hyclone Molecular Biology grade water |
| Iododeoxyuridine | Sigma | I7125 | IdU |
| Cryo vials | ThermoFisher | 366656PK | internal thread |
| Cell Staining buffer | Fluidigm | 201068 | Maxpar Cell Staining buffer |
| Fix & Perm buffer | Fluidigm | 201067 | Maxpar Fix & Perm buffer |
| Fix I buffer | Fluidigm | 201065 | Maxpar Fix I buffer |
| Phosphate buffered saline | Rockland | MB-008 | Metal free 10x PBS |
| isopropanol-freezing container | ThermoFisher | 5100-0001 | Mr.Frosty |
| Sodium hydroxide | Fisher | BP359-500 | NaOH |
| Petri dish | Kord-Valmark | 2900 | Supplied by Genesee 32-107 |
| 15 mL conical | Olympus/Genesee | 28-101 | |
| 50 mL conical | Olympus/Genesee | 28-106 | |
| 6-well plate | Cell Treat | 229506 | |
| Cisplatin | Sigma | 479306 | |
| Dispase II | Sigma/Roche | 4942078001 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Hydrochloric acid | Fisher | A144-212 | |
| Nuclear Antigen Staining permeabilization buffer | Fluidigm | 201063 | |
| Nuclear Antigen Staining buffer | Fluidigm | 201063 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Tuberculin syringe | BD | 309626 | |
| Type IV Collagenase | Worthington Bioscience | CLSS-4 |
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