Tomografia de coerência óptica 3D automatizada para elucidar a morfogênese do biofilme sobre grandes escalas espaciais
Summary
Os biofilmes microbianos formam arquiteturas complexas em interfases e se desenvolvem em padrões espaciais altamente dependentes de escala. Aqui, apresentamos um sistema experimental (Hard-e software) para a aquisição automatizada de conjuntos de dados de tomografia de coerência óptica 3D (OCT). Este conjunto de ferramentas permite a caracterização não invasiva e em várias escalas da morfogênese do biofilme no espaço e no tempo.
Abstract
Os biofilmes são um estilo de vida microbiano de maior sucesso e prevalecem em uma infinidade de configurações ambientais e projetadas. A compreensão da morfogênese do biofilme, que é a diversificação estrutural de Biofilo durante a montagem da Comunidade, representa um desafio notável em escalas espaciais e temporais. Aqui, nós apresentamos um sistema automatizado da imagem latente do biofilme baseado no tomography ótico da coerência (OCT). OCT é uma técnica emergente da imagem latente na pesquisa do biofilme. No entanto, a quantidade de dados que atualmente podem ser adquiridos e processados dificulta a inferência estatística de padrões de grande escala na morfologia do biofilme. O sistema automatizado de imagens de OCT permite cobrir grandes escalas temporais espaciais e estendidas de crescimento de biofilme. Ele combina um sistema OCT comercialmente disponível com uma plataforma de posicionamento robótico e um conjunto de soluções de software para controlar o posicionamento da sonda de digitalização OCT, bem como a aquisição e processamento de conjuntos de dados de imagem de biofilme 3D. Esta configuração permite a monitoração automatizada in situ e não invasora do desenvolvimento do biofilme e pode ser desenvolvida mais para acople a imagem latente de OCT com perfil do Macrofotografia e do microsensor.
Introduction
Os biofilmes são uma adaptação de estilo de vida microbiana de grande sucesso e estas comunidades Interphase-associadas e matriz-incluidas dos micro-organismos dominam a vida microbiana em ajustes naturais e industriais1,2. Lá, os biofilmes formam arquiteturas complexas, como flâmulas alongados3, ondulações4 ou tampas de cogumelo5 com importantes conseqüências para o crescimento do biofilme, estabilidade estrutural e resistência ao estresse6. Embora muito sobre a diferenciação estrutural de biofilme tenha sido aprendido a partir do trabalho em culturas de mono-espécies cultivadas em câmaras de fluxo em miniatura, a maioria dos biofilmes são comunidades altamente complexas, muitas vezes incluindo membros de todos os domínios da vida6. Apreciando esses biofilmes complexos como paisagens microbianas7 e entendendo como a estrutura e a função do biofilme interagem em comunidades complexas está, portanto, na vanguarda da pesquisa de biofilme.
Uma compreensão mecanicista da morfogênese de biofilmes complexos em resposta a pistas ambientais requer experimentos cuidadosamente projetados em conjunto com observações espacialmente e temporalmente resolvidas de estrutura física de biofilme em escalas8. No entanto, a observação não destrutiva do crescimento de biofilme em sistemas experimentais tem sido severamente limitada por restrições logísticas, como a necessidade de mover amostras (por exemplo, para um microscópio), muitas vezes danificando a delicada estrutura de biofilme.
O protocolo aqui apresentado introduz um sistema totalmente automatizado baseado na tomografia de coerência óptica (OCT), que permite o monitoramento in situ, não invasivo da morfogênese do biofilme na escala de mesoescala (mm). Oct é uma técnica emergente de imagem em pesquisa de biofilme com aplicações em tratamento de água e pesquisa Bioincrustação, medicina9 e fluxo ecológico10. Em OCT, uma fonte luminosa de baixa coerência é dividida em um braço de amostra e referência; a interferência da luz refletida e espalhada pelo biofilme (braço da amostra) e a luz do braço de referência é analisada. Uma série de perfis de intensidade axial (A-scans) que contém informações estruturais de profundidade resolvida é adquirida e mesclada em uma B-Scan (uma seção transversal). Uma série de B-varreduras adjacentes compõe a varredura final do volume 3D10. A OCT fornece uma resolução óptica lateral na faixa de aproximadamente 10 μm e, portanto, é bem adequada para o estudo da diferenciação estrutural mesoscópica de biofilmes10,12. Para uma descrição mais detalhada da OCT, consulte Drexler e Fujimoto13e fercher e colegas14. Embora o campo de visão de uma única varredura XY de OCT atinja até centenas de micrômetros quadrados, os padrões de maior escala não podem ser quantificados por meio de OCT em uma única varredura. No que diz respeito aos biofilmes em habitats naturais, como córregos e rios, isso limita atualmente a nossa capacidade de avaliar a morfogênese do biofilme em escalas que correspondem ao modelo físico e hidráulico do habitat.
A fim ultrapassar estes limites espaciais e adquirir varreduras de OCT automaticamente, uma ponta de prova da imagem latente do espectro-domínio OCT foi montada em um sistema de posicionamento de 3 eixos. A instalação permite a aquisição de várias varreduras de OCT em um padrão de mosaico sobreposto (varredura da telha), conseguindo eficazmente a imagem latente tomográfica de áreas de superfície até 100 cm2. Além disso, a alta precisão de posicionamento deste sistema permite monitorar de forma confiável o crescimento e o desenvolvimento de recursos de biofilme em locais específicos durante experimentos de longo prazo. O sistema é modular e os componentes individuais (isto é, dispositivo de posicionamento e OCT) da instalação podem ser usados como soluções autônomas ou combinados flexìvel. A Figura 1 fornece uma visão geral dos componentes de hard e software da instalação.
O sistema foi testado com um dispositivo de posicionamento CNC com controle de GRBL disponível comercialmente (tabela de materiais). As distâncias de funcionamento desta plataforma de posicionamento específico são 600 × 840 × 140 milímetro, com uma exatidão fabricante-indicada de +/-0, 5 milímetros e uma definição programável de 0, 5 milímetros. GRBL é uma fonte aberta (licença GPLv3), controle de movimento de capacidade elevada para o CNC Dispositivos. Portanto, cada dispositivo de posicionamento baseado em GRBL (versão > 1,1) deve ser compatível com as diretrizes e os pacotes de software apresentados aqui. Além disso, o software pode ser adaptado a outros controladores stepmotor com tipo de entrada STEP-DIR com poucas modificações.
O dispositivo de OCT usado para avaliar o desempenho do sistema (tabela de materiais) caracteriza uma fonte luminosa da baixa coerência com um comprimento de onda center de 930 nanômetro (largura de faixa = 160 nanômetro) e o comprimento e a intensidade ajustáveis do braço da referência. No exemplo apresentado aqui, um adaptador da imersão para mergulhar a ponta de prova de OCT na água de fluxo foi usado igualmente (tabela dos materiais). O pacote de software desenvolvido aqui para aquisição automatizada de varredura de OCT depende criticamente do SDK fornecido em conjunto com o sistema OCT específico, no entanto, os sistemas OCT do mesmo fabricante com diferentes lentes de digitalização e comprimentos de onda centrais devem ser facilmente compatível.
O dispositivo GRBL é controlado por um servidor Web instalado em um computador de placa única (Figura 1). Isso concede controle remoto do dispositivo a partir de qualquer computador com rede local ou acesso à Internet. O dispositivo OCT é controlado por um computador separado, permitindo a operação do sistema OCT de lado da configuração experimental automatizada. Finalmente, os pacotes de software incluem bibliotecas para sincronizar o posicionamento da sonda OCT e a aquisição de varredura de OCT (ou seja, para adquirir automaticamente conjuntos de dados de imagem 3D em um padrão de mosaico ou em um conjunto de posições definidas). Definir a posição da sonda OCT em 3D efetivamente permite ajustar o plano focal especificamente para conjuntos (regionais) de varreduras. Especificamente, em superfícies irregulares, diferentes planos focais (ou seja, diferentes posições na direção z) podem ser especificados para cada varredura de OCT.
Um conjunto de pacotes de software foi desenvolvido para processar varreduras de OCT RAW (tabela 1). A navegação do dispositivo de posicionamento, a aquisição de varredura de OCT e o processamento de conjuntos de dados são realizados com notebooks Jupyter codificados em Python, que permitem notável flexibilidade no desenvolvimento e otimização do software. Dois exemplos de trabalho e anotados de tais notebooks (para aquisição e processamento de imagens, respectivamente) estão disponíveis em https://gitlab.com/FlumeAutomation/automated-oct-scans-acquisition.git eles são destinados como pontos de partida para personalização do método. Um notebook Jupyter é um aplicativo baseado em navegador da Web que contém células com código Python anotado. Cada etapa está contida em uma célula do bloco de anotações, que pode ser executada separadamente. Devido ao comprimento diferente do trajeto claro através da lente da varredura (aberração esférica)15, os escaneamentos crus do Oct aparecem distorcidos (Figura 2a). Desenvolvemos um algoritmo para corrigir automaticamente essa distorção em varreduras de OCT adquiridas (contidas em Imageprocessing. ipynb, arquivo complementar 1). Além disso, a morfologia do biofilme pode ser visualizada como um mapa da elevação 2D, como foi usado previamente em sistemas de membrana16, e nós ilustramos como os mapas da elevação obtidos das varreduras tomadas em uma disposição de telha podem ser costurados.
Finalmente, a funcionalidade da instalação laboratorial descrita é ilustrada usando um experimento de Flume em que o biofilme de fluxo fototrófico é exposto a um gradiente de velocidade de fluxo.
Protocol
Representative Results
Discussion
A imagem latente de OCT é poço-serido para resolver estruturas na escala do micrômetro com um FOV de diversos milímetros quadrados. É, portanto, uma ferramenta poderosa para a pesquisa de biofilme10,18. No entanto, a OCT está atualmente limitada a uma área de varredura máxima de 100-256 mm2, enquanto os padrões estruturais de biofilme geralmente excedem essa escala espacial19, especialmente quando a diferenciação morf…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Mauricio Aguirre Morales por sua contribuição para o desenvolvimento deste sistema. O apoio financeiro veio da Swiss National Science Foundation para a T.J.B.
Materials
| OCT Probe | Thorlabs | GAN210C1 | OCT imaging device |
| OCT scan lens | Thorlabs | OCT-LK3-BB | |
| Immersion adapter | Thorlabs | OCT-IMM3-SP1 | |
| Stepcraft 840 CK | STEPCRAFT | NA | positioning device |
| microcontroller | Arduino Uno R3 | NA | |
| Single-board computer | Raspberry PI | NA | |
| camera | Canon EOS 7D Mark II | NA | |
| camera lens | Canon MACRO EFS 35 mm | NA |
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