Büyük Uzamsal Ölçekler Üzerinde Biyofilm Morfogenezini Açıklamak için Otomatik 3D Optik Koherens Tomografisi
Summary
Mikrobiyal biyofilmler interfazlarda karmaşık mimariler oluşturur ve yüksek ölçekli-bağımlı uzamsal desenler halinde gelişirler. Burada, 3D optik koherens tomografisi (OCT) veri kümelerinin otomatik olarak edinimi için deneysel bir sistem (sert ve yazılım) sıyoruz. Bu araç seti, uzay ve zamanda biyofilm morfogenezinin non-invaziv ve çok ölçekli karakterizasyonuna olanak sağlar.
Abstract
Biyofilmler en başarılı mikrobiyal yaşam tarzı dır ve çok sayıda çevresel ve mühendislik ortamlarında hakimdir. Biyofilm morfogenezi anlamak, yani topluluk meclisi sırasında biyofilmlerin yapısal çeşitlendirilmesi, mekansal ve zamansal ölçekler arasında dikkate değer bir meydan okumayı temsil etmektedir. Burada optik koherens tomografisine (OKT) dayalı otomatik bir biyofilm görüntüleme sistemi salıyoruz. OCT biyofilm araştırmalarında ortaya çıkan bir görüntüleme tekniğidir. Ancak, şu anda elde edilebilen ve işlenebilen veri miktarı, biyofilm morfolojisinde büyük ölçekli desenlerin istatistiksel çıkarımını engellemektedir. Otomatik OCT görüntüleme sistemi biyofilm büyüme büyük mekansal ve genişletilmiş zamansal ölçekler kapsayan sağlar. Bir robot konumlandırma platformu ve OCT tarama sondasının konumlandırılmasını kontrol etmek için bir dizi yazılım çözümleri ile ticari olarak kullanılabilir bir OCT sistemini birleştirir, ayrıca 3D biyofilm görüntüleme veri kümelerinin edinimi ve işlenmesini de. Bu kurulum biyofilm geliştirme yerinde ve non-invaziv otomatik izleme sağlar ve daha fazla makrofotoğrafçılık ve mikrosensör profilleme ile çift OCT görüntüleme için geliştirilebilir.
Introduction
Biyofilmler son derece başarılı bir mikrobiyal yaşam tarzı adaptasyon ve mikroorganizmaların bu interfaz ilişkili ve matris kaplı topluluklar doğal ve endüstriyel ortamlarda mikrobiyal yaşam hakim1,2. Orada, biyofilmler karmaşık mimariler oluşturur, uzatılmış flamalar gibi3, dalgalanmalar4 veya mantar gibi kapaklar5 biyofilm büyüme için önemli sonuçları ile, yapısal istikrar ve strese direnç6. Biyofilm yapısal farklılaşma hakkında çok minyatür akış odalarında yetiştirilen mono-tür kültürleri üzerinde çalışma öğrenilmiş olsa da, çoğu biyofilm genelliklehayatıntüm etki alanları nın üyeleri de dahil olmak üzere son derece karmaşık topluluklar 6 . Bu karmaşık biyofilmlerin mikrobiyal manzaralar7 olarak takdir edilerek, biyofilm yapısının ve işlevinin karmaşık topluluklarda nasıl etkileştiğini anlamak biyofilm araştırmalarında ön plandadır.
Çevresel ipuçlarına yanıt olarak karmaşık biyofilmlerin morfogenezinin mekanistik bir şekilde anlaşılması, biyofilm fiziksel yapısının mekansal ve zamansal olarak çözümlenmiş gözlemleri ile birlikte dikkatle tasarlanmış deneyler gerektirir. ölçekler8. Ancak, deneysel sistemlerde biyofilm büyümesinin tahribatsız gözlemi, numunelerin (örneğin mikroskoba) taşınması ihtiyacı gibi lojistik kısıtlamalarla ciddi ölçüde sınırlandırılmıştır.
Burada sunulan protokol, biyofilm morfogenezinin mezoölçekte (mm aralığında) insitu, non-invaziv olarak izlenmesine olanak tanıyan optik koherens tomografisine (OCT) dayalı tam otomatik bir sistem sunmaktadır. OCT su arıtma ve biyofouling araştırma, tıp9 ve akarsu ekoloji10uygulamaları ile biyofilm araştırma ortaya çıkan bir görüntüleme tekniğidir. OCT’de, düşük tutarlılıklı bir ışık kaynağı örnek ve referans koluna ayrılır; biyofilm (örnek kol) tarafından yansıyan ve dağılan ışığın paraziti ve referans kolunun ışığı analiz edilir. Derinliği çözülmüş yapısal bilgileri içeren bir dizi eksenel yoğunluk profili (A-taramaları) elde edilir ve B-taraması (bir kesit) ile birleştirilir. Bitişik B-taramaları bir dizi son 3D hacim tarama10oluşturur. OCT yaklaşık 10 μm aralığında bir yanal optik çözünürlük sağlar ve bu nedenle iyi biyofilmlerin mezoskopik yapısal farklılaşma incelemek için uygundur10,12. OCT daha ayrıntılı bir açıklama için, Drexler ve Fujimoto13ve Fercher ve meslektaşları14bakın. Tek bir OCT xy-scan’ın görüş alanı yüzlerce mikrometreye kadar ulaşsa da, daha büyük ölçekli desenler tek bir tarak OCT ile ölçülemez. Akarsu ve nehir gibi doğal habitatlarda biyofilmler ile ilgili olarak, bu şu anda yaşam alanının fiziksel ve hidrolik şablonu eşleşen ölçeklerde biyofilm morfogenez değerlendirmek için yeteneğimizi sınırlar.
Bu uzamsal sınırları aşmak ve OCT taramalarını otomatik olarak elde etmek için 3 eksenli bir konumlandırma sistemine spektral etki alanı OCT görüntüleme probu monte edilmiştir. Kurulum, 100 cm 2’ye kadar yüzey alanlarının tomografik görüntülemesini etkin bir şekilde sağlayarak, çakışan mozaikdesenli (çini taraması) birkaç OCT taramasının elde edilmesine izin verir. Ayrıca, bu sistemin yüksek konumlandırma hassasiyeti, uzun süreli deneyler sırasında belirli sitelerdeki biyofilm özelliklerinin büyümesini ve gelişimini güvenilir bir şekilde izlemenizi sağlar. Sistem modüler ve tek tek bileşenleri (yani, konumlandırma cihazı ve OCT) kurulum bağımsız çözümler olarak kullanılabilir veya esnek kombine. Şekil 1, kurulumun sabit ve yazılım bileşenlerine genel bir bakış sağlar.
Sistem, ticari olarak kullanılabilen GRBL kontrollü CNC konumlandırmacihazı (Malzeme Tablosu) ile test edilmiştir. Bu özel konumlandırma platformunun çalışma mesafeleri 600×840×140 mm olup, üretici tarafından +/- 0,05 mm ve 0,005 mm. GRBL programlanabilir çözünürlüğe sahip bir açık kaynak (GPLv3 Lisansı), CNC için yüksek performanslı hareket kontrolü Aygıtları. Bu nedenle, her GRBL tabanlı (sürüm > 1)’lik konumlandırma cihazı burada sunulan yönergeler ve yazılım paketleriyle uyumlu olmalıdır. Ayrıca, yazılım birkaç değişiklik ile STEP-DIR giriş türü ile diğer stepmotor denetleyicileri adapte edilebilir.
Sistemin performansını değerlendirmek için kullanılan OCTcihazı (Tablo Malzemeler) 930 nm (bant genişliği = 160 nm) merkezi dalga boyuna ve ayarlanabilir referans kol uzunluğu ve yoğunluğuna sahip düşük tutarlılık ışık kaynağına sahiptir. Burada sunulan örnekte, OCT probu akan suya daldırılan bir daldırma adaptörü de kullanılmıştır (Malzeme Tablosu). Otomatik OCT tsam alımı için burada geliştirilen yazılım paketi kritik sdk belirli OCT sistemi ile birlikte sağlanan bağlıdır, ancak, farklı tsam lensler ve merkezi dalga boyları ile aynı üreticinin OCT sistemleri olmalıdır kolayca uyumludur.
GRBL aygıtı tek kartlı bir bilgisayara yüklenen birweb sunucusu tarafından kontrol edilir (Şekil 1). Bu, yerel ağ veya internet erişimi olan herhangi bir bilgisayardan aygıtın uzaktan kontrol sağlar. OCT cihazı ayrı bir bilgisayar tarafından kontrol edilir ve OCT sisteminin otomatik deneysel kurulumu bir kenara bırakarak çalışmasını sağlar. Son olarak, yazılım paketleri, OCT sonda konumlandırma ve OCT taraması edinimi (yani, otomatik olarak mozaik desen veya tanımlanmış pozisyonlar kümesi nde 3D görüntüleme veri setleri elde etmek) senkronize etmek için kütüphaneler içerir. OCT probunun 3B’deki konumunun etkin bir şekilde tanımlanması, odak düzleminin (bölgesel) tarama kümeleri için özel olarak ayarlanmasına olanak tanır. Özellikle, pürüzlü yüzeylerde, her OCT tarariçin farklı odak düzlemleri (yani z yönünde farklı konumlar) belirtilebilir.
Ham OCT taramalarını işlemek için bir dizi yazılım paketi geliştirilmiştir (Tablo 1). Konumlandırma cihazının navigasyonu, OCT tarak edinimi ve veri seti işleme, yazılımın geliştirilmesi ve optimizasyonunda dikkate değer esneklik sağlayan Python kodlu Jupyter dizüstü bilgisayarlarla gerçekleştirilir. Bu tür defterlerin iki çalışılan ve açıklamalı örnekleri (sırasıyla görüntü edinme ve işleme için) https://gitlab.com/FlumeAutomation/automated-oct-scans-acquisition.git Özelleştirme için başlangıç noktası olarak tasarlanmıştır yönteminin. Jupyter dizüstü bilgisayar, açıklamalı Python koduna sahip hücreleri içeren web tarayıcısı tabanlı bir uygulamadır. Her adım, ayrı olarak yürütülebilen not defterinin bir hücresinde bulunur. Tarama merceğinden ışık yolunun farklı uzunluğu nedeniyle (küresel sapma)15, ham OCT taramaları bozuk görünür (Şekil 2A). Edinilmiş OCT taramalarında bu bozulmayı otomatik olarak düzeltmek için bir algoritma geliştirdik (ImageProcessing.ipynb, Ek Dosya1’de yeralmaktadır). Ayrıca, biyofilm morfolojisi daha önce membran sistemlerinde 16 olarak kullanılanbir 2D yükseklik haritası olarak görselleştirilebilir ve fayans dizisinde çekilen taramalardan elde edilen yükseklik haritalarının nasıl dikilebildiğini gösteriyoruz.
Son olarak, açıklanan laboratuvar kurulumunun işlevselliği, fototrofik akarsu biyofilminin akış hızının bir degradesine maruz kıldığı bir flume deneyi kullanılarak gösterilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
OCT görüntüleme de birkaç milimetre kare bir FOV ile mikrometre aralığında yapıları çözmek için uygundur. Böylece biyofilm araştırma için güçlü bir araçtır10,18. Ancak, OCT şu anda 100 maksimum tazyik alanı ile sınırlıdır – 256 mm2, biyofilm yapısal desenler genellikle bu mekansal ölçek aşaniken 19, özellikle morfolojik farklılaşma büyük ölçekli çevresel degradeler tarafından tahrik edilir…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Mauricio Aguirre Morales’e bu sistemin gelişimine katkılarından dolayı teşekkür ederiz. İsviçre Ulusal Bilim Vakfı’ndan T.J.B.’ye finansal destek geldi.
Materials
| OCT Probe | Thorlabs | GAN210C1 | OCT imaging device |
| OCT scan lens | Thorlabs | OCT-LK3-BB | |
| Immersion adapter | Thorlabs | OCT-IMM3-SP1 | |
| Stepcraft 840 CK | STEPCRAFT | NA | positioning device |
| microcontroller | Arduino Uno R3 | NA | |
| Single-board computer | Raspberry PI | NA | |
| camera | Canon EOS 7D Mark II | NA | |
| camera lens | Canon MACRO EFS 35 mm | NA |
References
- Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nature reviews. Microbiology. 8, 623-633 (2010).
- Flemming, H. -. C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature reviews. Microbiology. 14, 563 (2016).
- Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Oscillation characteristics of biofilm streamers in turbulent flowing water as related to drag and pressure drop. Biotechnology and Bioengineering. 57, 536-544 (1998).
- Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. The formation of migratory ripples in a mixed species bacterial biofilm growing in turbulent flow. Environmental microbiology. 1, 447-455 (1999).
- Banin, E., Vasil, M. L., Greenberg, E. P. Iron and Pseudomonas aeruginosa biofilm formation. Proceedings of the Natural Academy of Sciences U.S.A. 102, 11076-11081 (2005).
- Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. The ecology and biogeochemistry of stream biofilms. Microbiology. 14, 251-263 (2016).
- Battin, T. J., et al. Microbial landscapes: new paths to biofilm research. Nature Reviews. Microbiology. 5, 76-81 (2007).
- Neu, T. R., Lawrence, J. R. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends in Microbiology. 23, 233-242 (2015).
- Meleppat, R. K., Shearwood, C., Seah, L. K., Matham, M. V. Quantitative optical coherence microscopy for the in situ investigation of the biofilm. J. of Biomedical Optics. 21 (12), 127002 (2016).
- Wagner, M., Horn, H. Optical coherence tomography in biofilm research: A comprehensive review. Biotechnology and Bioengineering. 114, 1386-1402 (2017).
- Huang, D., et al. Optical coherence tomography. Science. 254, 1178-1181 (1991).
- Haisch, C., Niessner, R. Visualisation of transient processes in biofilms by optical coherence tomography. Water Resources. 41, 2467-2472 (2007).
- Drexler, W., Fujimoto, J. G. . Optical Coherence Tomography: Technology and Applications. , (2008).
- Fercher, A. F. Optical coherence tomography – development, principles, applications. Zeitschrift für Medizinische Physik. 20, 251-276 (2010).
- Lee, H. -. C., Liu, J. J., Sheikine, Y., Aguirre, A. D., Connolly, J. L., Fujimoto, J. G. Ultrahigh speed spectral-domain optical coherence microscopy. Biomedical Optics Express. , 41236-41254 (2013).
- Fortunato, L., Leiknes, T. In-situ biofouling assessment in spacer filled channels using optical coherence tomography (OCT): 3D biofilm thickness mapping. Bioresource Technology. 229, 231-235 (2017).
- Niederdorfer, R., Peter, H., Battin, T. J. Attached biofilms and suspended aggregates are distinct microbial lifestyles emanating from differing hydraulics. Nature Microbiology. 1, 16178 (2016).
- Roche, K. R., et al. Benthic biofilm controls on fine particle dynamics in streams. Water Resources. 53, 222-236 (2016).
- Fortunato, L., Jeong, S., Wang, Y., Behzad, A. R., Leiknes, T. Integrated approach to characterize fouling on a flat sheet membrane gravity driven submerged membrane bioreactor. Bioresource Technology. 222, 335-343 (2016).
- Morgenroth, E., Milferstedt, K. Biofilm engineering: linking biofilm development at different length and time scales. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 8, 203-208 (2009).
