Eine detaillierte Anleitung ist wie ein stark geneigten bauen beschrieben fegte Kachel (HIST) Mikroskop und dessen Nutzung für die Einzelmolekül-Bildgebung.
Einzelmolekül-Bildgebung hat unser Verständnis der molekularen Mechanismen in biologischen Studien erheblich vorangebracht. Allerdings ist es schwierig, große Field-of-View, kontrastreiche Bilder mit dicken Zellen und Geweben zu erhalten gewesen. Hier stellen wir stark geneigten gefegt Kachel (HIST) Mikroskopie, die dieses Problem überwindet. Ein paar Zylinderlinsen wurde implementiert, um eine längliche Erregung Strahl zu generieren, der großflächig imaging über eine schnelle Galvo-Spiegel gescannt wurde. Eine 4f -Konfiguration wurde verwendet, um optische Komponenten zu positionieren. Eine wissenschaftliche ergänzende Metall-Oxid-Halbleiter-Kamera das Fluoreszenzsignal erkannt und blockiert die Out-of-Focus-Hintergrund mit einem dynamischen konfokale Schlitz mit der Strahl fegen synchronisiert. Wir präsentieren Ihnen eine Schritt für Schritt Anleitung auf den Aufbau der HIST-Mikroskop mit allen Basiskomponenten.
Einzelmolekül-Fluoreszenz-Bildgebung spielt eine wichtige Rolle in vielen biologischen Studien, die zeigen Feinstrukturen, Dynamik und die Menge von Biomolekülen1,2,3. Jedoch hat es eine Herausforderung gewesen, um Single-Molekülen in Zellen oder Gewebe zu studieren. Konfokale Mikroskopie hohe Stationspunkte Fähigkeit4bietet, eignet sie sich nicht für die Einzelmolekül-Bildgebung aufgrund schwerer Immunofluoreszenz durch die hohe Erregung Intensität oder langsame Bildgebung. Weitfeld-Mikroskopie nutzt schwächere Ausleuchtung aber leidet ein schlechtes Signal an Hintergrund-Verhältnis (SBR)5. Licht-Blatt-Mikroskopie, konnte auf der anderen Seite gut schneiden und niedrigen Immunofluoreszenz6zeigen; jedoch ist der verfügbaren numerische Apertur (NA) von dem Erfordernis der Orthogonal platzierte Ziele7stark eingeschränkt. Alternativ erfordert spezielle Beleuchtungen und Probe Kammern8,9.
Aus diesen Gründen hat stark geneigt und laminierte optische Blatt (HILO) Mikroskopie für 3D Einzelmolekül-imaging10verbreitet. Stößt eine schräge Balken eine Schnittstelle von zwei Medien (Glas und Wasser, zum Beispiel), wird der Strahl nach Snell Gesetz gebrochen. Wichtig ist, der gebrochene Strahl wird dünner, und seine Stärke bezeichnet man als Dz = R/tan(θ) wo R ist der Durchmesser des Strahls geneigt und θ ist der Winkel, Brechung des transmittierten Strahl. Diese einfache Implementierung führt eine gute Stationspunkte Fähigkeit. Dennoch zeigt diese Beziehung, dass eine dünne Beleuchtung (d. h. hohe Stationspunkte Fähigkeit) ein kleines R und/oder eine große θ erfordert. Zum Beispiel, wenn R = 20 µm und θ = 72 Grad, man kann erhalten Dz = 6,5 µm. Da gibt es eine praktische Begrenzung zur Steigerung des Brechung Winkels zur image-tief im Inneren der Zellen und zur Vermeidung von Totalreflexion, gibt es eine starke Kopplung von Beleuchtung Durchmesser und die Dicke der Balken. Aus diesem Grund zeigt HILO Bildgebung eine relativ kleine Field-of-View (FOV), die ihre Anwendungen in mehrzelligen Bildgebung erheblich einschränkt.
Vor kurzem haben wir dieses Problem durch stark geneigten gefegt Kachel (HIST) Mikroskopie überwinden, wo die FOV von der Dicke Strahl in eine sehr einfache Art und Weise11entkoppelt ist. Zunächst wird ein Strahl in eine Richtung gestreckt über ein paar Zylinderlinsen generiert. Dieser Strahl, bezeichnet als Kachel, erzeugt eine dünne Beleuchtung mit Dz ~ 4 µm, während seine FOV 130 x 12 µm2ist. Dann ist die Fliese über die Probe mit einem rotierenden Galvo-Spiegel fegte. Unterdessen wird die Fluoreszenzbild auf einem wissenschaftlichen ergänzende Metall-Oxid-Halbleiter (sCMOS) Kamera aufgezeichnet, die filtert effizient unscharfen Hintergrund durch den Betrieb in eine rolling Shutter-Modus dient als durchstimmbare konfokale Schlitz-Erkennung. Auf diese Weise ermöglicht HIST Mikroskopie Einzelmolekül-Bildgebung mit ein größeres Sichtfeld (~ 130 x 130 µm2) und eine dünnere Ausleuchtung als HILO Bildgebung. Wir galt das neue bildgebende Technik um RNA-Transkripte zu erkennen, mit einer einzigen Sonde in Zellen oder mit ein paar Sonden in Maus Hirngewebe, die erhebliches Potenzial für die Untersuchung der Genexpression und Krankheiten hat. Im Gegensatz zu anderen Ansätzen HIST beschäftigt nur einen einzigen hoher numerischer Apertur Ziel ohne eine zusätzliche Beleuchtung oder Fernerkennung Ziele und ist voll kompatibel mit umgekehrten Mikroskopen. Diese Vorteile zusammen mit einem großen FOV und hohem Kontrast machen HIST Mikroskopie eines prominenten Instrument in Biologie und Medizin. Wir präsentieren Ihnen detaillierte Anweisungen bezüglich Instrumentierung des HIST Mikroskop und Gewusst wie: testen und seine Leistung wie folgt zu kalibrieren.
Es gibt zwei wichtige Schritte in diesem Protokoll. Die erste ist die richtige Platzierung von L4 im Schritt 3.3, um sicherzustellen, dass der einfallende Strahl durch die Mitte der Linse verläuft und eine perfekte Airy Scheibe Muster an der Decke entsteht. Die Position des L4 bestimmt die Platzierung aller anderen optischen Komponenten, einschließlich der M5, L2, L3 und GM. Der zweite wichtige Schritt ist die Synchronisation. Um die Out of Focus Hintergrund abzulehnen, sollten aktive Pixel, deren effiziente Detektion Breite gleich der Breite der Fliese ist, mit Strahl fegen synchronisiert werden. Daher ist es notwendig, die effektive Beleuchtung Breite eines Balkens Kachel (Schritt 5.6) zu messen und Set Kameraparameter entsprechend Schritt in 6.4.
Wenn mit sehr großen FOV imaging, zeigt die vorgestellte Methode einen erhöhte Hintergrund auf der einen Seite im Vergleich zu der anderen Seite. Dies ist zurückzuführen auf leicht veränderter Winkel der Beleuchtung an verschiedenen bildgebenden Positionen. Umsetzung eines zweiten Galvo-Spiegels anstelle von M5 lindert dieses Problem wie gezeigt durch synchron Verstellen der Position und der Scan Winkel11vor. Statt ab Lager achromatischen Doublets wird eine telezentrischen Scan Objektiv auch hilfreich sein. Jedoch für eine Fläche von imaging < 8.080 µm2, einzelne Galvo Spiegel kehren war ausreichend. HIST-Mikroskopie hat ein Limit von bildgebenden Tiefe, allerdings ist es eine gute SBR erhalten beim bis zu ~ 15 µm mit einem 12 µm Fliese Strahl und ein NA 1,45 Öl eintauchen Objektiv11abbilden können.
In diesem Protokoll haben wir ein Strahl Komprimierungsverhältnis von 8 um einen Kachel-Strahl zu machen. Eine dünnere Beleuchtung lässt sich um höhere SBR zu erreichen, die möglicherweise stark für Einzelmolekül-Gewebe imaging11in der HIST Mikroskopie. Allerdings sollte in diesem Fall Immunofluoreszenz-Effekt durch eine erhöhte Erregung Intensität betrachtet werden während der aktuellen Strahl Verdichtungsverhältnis reduzierte Immunofluoreszenz in 3D Bildgebung im Vergleich zu Epi11zeigte. Im Vergleich zu Licht-Blatt Mikroskope mit zwei Orthogonal platzierte Zielen, ist HIST Mikroskopie einfach zu implementieren und kompatibel mit herkömmlichen Probe Vorbereitungen. Die verbesserte SBR und großen FOV HIST-Mikroskopie ist geeignet für die Untersuchung der Interaktionen und Dynamik der einzelnen Biomoleküle in mehreren Zellen und kann weiter verwendet werden in Höchstauflösung Bildgebung und Einzelmolekül-Tracking.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde von der Defense Advanced Research Projekte Agency (DARPA) (HR00111720066) und National Science Foundation (NSF) (1805200) unterstützt. Wir danken Michael Serge in Andor Technology für großzügig die sCMOS Kamera ausleihen.
1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-060-A-ML | Collimator |
1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-100-A-ML | L1,L2 |
1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-300-A-ML | TL |
1" Broadband Dielectric Mirrors | Thorlabs | BB1-E02-10 | M1~M7 |
1" Cylindrical Lenses | Thorlabs | LJ1363RM-A | CL1 |
1" Cylindrical Lenses | Thorlabs | LJ1695RM-A | CL2 |
1" square kinematic mount | Edmund Optics | 58-857 | For dichroic mirror mounting |
1" Threaded Cage Plate | Thorlabs | CP02 | For holding other lenses |
2" Achromatic doublet | Thorlabs | AC508-150-A-ML | L3 |
2" Achromatic doublet | Thorlabs | AC508-400-A-ML | L4 |
2" Threaded Cage Plate | Thorlabs | LCP01 | For holding L4 |
2" Threaded Cage Plate | Thorlabs | LCP01T | For holding L3 |
2% Bis Solution | Bio Rad | 64085292 | hydrogel component |
20 nm fluorescent beads | Thermo Fisher | F8782 | For testing imaging |
30 mm Cage Right-Angle Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | KCB1 | For objective & camera mounting |
30mm Cage System Iris | Thorlabs | CP20S | |
3-Axis NanoMax Stage | Thorlabs | MAX311D | |
40% Acrylamide Solution | Bio Rad | 64148001 | hydrogel component |
405 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-MLD | |
50x TAE buffer | Bio-Rad | 161-0743 | hydrogel component |
561 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-DPL | |
638 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-MLD | |
Ammonium persulfate | Sigma | A3678-25G | hydrogel component |
Beam alignment tool | custom made | ||
BNC terminal blocks | Natural Instruments | BNC-2110 | |
Cage plate with M9 x 0.5 internal threads | Thorlabs | CP1TM09 | For holding aspheric lens |
Cage System Rods | Thorlabs | SR series | |
Cell culture & smFISH | See a reference [11] | ||
Double side tape | Scotch | 515182 | Flow chamber |
Epoxy | Devcon | 14250 | Flow chamber |
Galvo mirror | Thorlabs | GVS211 | GM |
Galvo System Linear Power Supply | Thorlabs | GPS011 | |
Half wave plate | Thorlabs | WPH10M-405/561/633 | Power adjustment |
long-pass dichroic mirror | Chroma | T550lpxr | For combining lasers |
Microscope slides | Fisherbrand | 12549-3 | Flow chamber |
Mikroskopische Deckglaser | Hecht Assistent | 990/5024 | Flow chamber |
Mounted Frosted Glass Alignment Disk | Thorlabs | DG10-1500-H1-MD | For double pinhole system |
Mounted rochester aspheric lens | Thorlabs | A230TM-A | |
Multi-band dichroic mirror | Semrock | Di03-R405/488/561/635-t3 | DM; 3 mm thickness |
Multi-band filter | Semrock | FF01-446/523/600/677-25 | BF |
Multimode fiber | Thorlabs | M31L02 | MMF |
N,N,N',N'-tetramethyl ethylenediamine | Sigma | T7024-25ML | hydrogel component |
NI-DAQ board | Natural Instruments | PCI-6733 | |
Ø1" Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | KM100 | For holding mirrors |
Objective lens | Olympus | PLANAPO N 60X | 60X 1.45NA oil |
Pedestal Base Clamping Forks | Newport | 9916 | |
Pedestal Pillar Posts | Thorlabs | RS1P8E | |
Piezo controller | Thorlabs | BPC303 | |
Polarized beam splitter | Thorlabs | PBS251 | For combining lasers |
RMS-SM1 adapter | Thorlabs | SM1A3TS | For objective lens |
Rod holder | custom made | ||
Rotation cage mount | Thorlabs | RSP1/CRM1/CRM1P | For HWP & cylindrical lens mounting |
sCMOS camera | Andor | Zyla-4.2P-CL10 | |
Shearing interferometer | Thorlabs | SI100 | Beam collimation test |
Single mode fiber | Thorlabs | P5-405BPM-FC-2 | SMF |
SM1 Lens Tubes | Thorlabs | SM1S25 | For double pinhole system |
SM1 Slotted Lens Tube | Thorlabs | SM1L30C | For double pinhole system |
Stage mount | custom made | ||
threaded fiber adapter | Thorlabs | SM1FC | |
Z-Axis Translation Mount | Thorlabs | SM1Z | Fiber coupling |