Uma instrução detalhada é descrita em como construir um altamente inclinado varrido telha (HIST) microscópio e seu uso para a imagem latente de único-molécula.
Imagem de único-molécula avançou grandemente nossa compreensão dos mecanismos moleculares em estudos biológicos. No entanto, tem sido um desafio para obter imagens grandes do campo de visão, alto contraste em grossas células e tecidos. Aqui, apresentamos a microscopia de telha varrida altamente inclinado (HIST) que resolve este problema. Um par de lentes cilíndricas foi implementado para gerar um feixe de excitação alongada que foi verificado em uma grande área de imagem através de um espelho galvo rápido. Uma configuração de 4f foi usada para posicionar os componentes ópticos. Uma câmera científico semicondutor de óxido metálico complementar detectou o sinal de fluorescência e bloqueou o fundo fora de foco com uma fenda confocal dinâmica sincronizada com a varrição de feixe. Apresentamos um passo a passo instruções sobre o microscópio HIST com todos os componentes básicos de construção.
Imagem de único-molécula fluorescência desempenha um papel importante em muitos estudos biológicos que revelam ultrastructures, dinâmica e a quantidade de biomoléculas1,2,3. No entanto, isso tem sido desafiador para estudar single-moléculas no interior das células ou tecidos. Microscopia confocal fornece alta corte capacidade4, não é apropriado para a imagem latente de único-molécula devido à severo fotobranqueamento pela excitação de alta intensidade ou velocidade lenta de imagem. Microscopia Widefield usa iluminação mais fraca, mas sofre de um sinal de fundo ratio (SBR)5. Microscopia de luz-folha, por outro lado, poderia mostrar bom corte e baixa fotobranqueamento6; no entanto, a disponível abertura numérica (NA) é grandemente limitada pela exigência de objectivos colocados ortogonalmente7. Alternativamente, requer especiais iluminadores e amostra câmaras8,9.
Por estas razões, a microscopia folha óptica altamente inclinado e laminado (HILO) tem sido amplamente utilizada para 3D único-molécula de imagem10. Quando um feixe inclinado encontra uma interface de dois meios (vidro e água, por exemplo), o feixe é refratado de acordo com a lei de Snell. Importante, o feixe refratado fica mais fino, e sua espessura é descrita como dz = R/tan(θ), onde R é o diâmetro do feixe inclinado e θ é o ângulo de refração do feixe transmitido. Essa implementação simples resulta em uma boa capacidade de corte. No entanto, esta relação indica que uma iluminação fina (ou seja, alta capacidade corte) requer um pequeno R e/ou um θ grande. Por exemplo, quando R = 20 µm e θ = 72 graus, um pode obter dz = 6,5 µm. Desde que há um limite prático para aumentar o ângulo de refração para dentro de células de imagem e evitar a reflexão interna total, há um acoplamento forte de diâmetro a iluminação e a espessura do feixe. Por esta razão, as imagens de HILO mostram um relativamente pequeno campo de visão (FOV) que restringe consideravelmente suas aplicações em imagiologia multicelular.
Recentemente, ultrapassámos esse problema por microscopia de telha varrida altamente inclinado (HIST) onde o FOV é desassociado a espessura do feixe em uma maneira muito simples de11. Primeiro, um feixe alongado em uma direção é gerado através de um par de lentes cilíndricas. Este feixe, denominado como um azulejo, produz uma iluminação fina com dz ~ 4 µm enquanto sua FOV é 130 x 12 µm2. Em seguida, a telha é varreu a amostra usando um espelho rotativo do galvo. Enquanto isso, a imagem de fluorescência é gravada em uma câmera de científico de semicondutor de óxido metálico complementar (sCMOS) que filtra o fundo fora de foco com eficiência, operando em um modo de obturador de rolamento que serve como detecção de fenda confocal ajustáveis. Desta forma, HIST microscopia permite imagem de único-molécula com um maior campo de visão (~ 130 x 130 µm2) e uma iluminação mais fina do que a imagem do HILO. Nós aplicamos esta imagem nova técnica para detectar os transcritos de RNA com um único teste em células ou com alguns testes nos tecidos do cérebro de rato, que tem um potencial significativo para o estudo de doenças e expressão gênica. Ao contrário de outras abordagens, HIST emprega apenas um objectivo único abertura numérica elevada sem um iluminador adicional ou objectivos de detecção remota e é totalmente compatível com microscópios invertidos. Estas vantagens junto com um grande FOV e alto contraste fará HIST microscopia uma ferramenta proeminente em biologia e medicina. Apresentamos instruções detalhadas sobre instrumentação de microscópio HIST e como testar e calibrar seu desempenho como abaixo.
Há duas etapas críticas neste protocolo. A primeira é a colocação apropriada do L4 na etapa 3.3, garantindo que o feixe incidente passa através do centro da lente e um padrão perfeito disco de Airy é formado no teto. A posição de L4 determina a colocação de todos os outros componentes ópticos, incluindo L2, L3, GM e M5. O segundo passo crítico é o processo de sincronização. Para rejeitar a fora do plano de foco, pixels ativos cuja largura de detecção eficaz é igual à largura da telha devem ser sincronizados com a varrição de feixe. Portanto, é necessário medir a largura de iluminação eficaz de um feixe de telha (etapa 5.6) e parâmetros de ajuste de câmera em conformidade na etapa 6.4.
Quando imagem com FOV muito grande, o método apresentado mostra um aumento do fundo de um lado, em comparação com o outro lado. Isto é atribuído ao ligeiramente alterados ângulos de iluminação em diferentes posições da imagem latente. Implementar um segundo espelho galvo em vez de M5 alivia este problema como demonstrado antes, sincronicamente, ajustando a posição e o ângulo varredura11. Em vez de criação acromáticas parelhas, uma lente de varredura de telecêntrico será também útil. No entanto, para uma área de imagem < 8.080 µm2, galvo único espelho varrição era suficiente. Microscopia HIST tem um limite da profundidade da imagem, no entanto, é capaz de obter um bom SBR quando até ~ 15 µm com um feixe de telha 12 µm e uma de lente objetiva de imersão111,45 nd óleo de imagem.
Neste protocolo, fazíamos uma taxa de compressão do feixe de 8 um feixe de telha. Uma iluminação mais fina pode ser usada em microscopia HIST para alcançar maior SBR, que pode ser poderosa para tecido único-molécula de imagem11. No entanto, neste caso, fotobranqueamento efeito deve ser considerado por uma intensidade maior excitação enquanto a atual taxa de compressão do feixe mostrou fotobranqueamento reduzido em imagem em 3D em comparação com Epi11. Em comparação com microscópios de luz-folha com dois objectivos colocados ortogonalmente, microscopia HIST é simples de implementar e compatível com as preparações convencionais de amostra. A SBR reforçada e grande FOV de microscopia HIST é apropriado para estudar as interações e dinâmica de biomoléculas única em várias células e pode ser usado mais em Super-resolução imaging e rastreamento único-molécula.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pela Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) (HR00111720066) e National Science Foundation (NSF) (1805200). Agradecemos a Michael Serge em Andor tecnologia para emprestar-se generosamente a câmera sCMOS.
1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-060-A-ML | Collimator |
1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-100-A-ML | L1,L2 |
1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-300-A-ML | TL |
1" Broadband Dielectric Mirrors | Thorlabs | BB1-E02-10 | M1~M7 |
1" Cylindrical Lenses | Thorlabs | LJ1363RM-A | CL1 |
1" Cylindrical Lenses | Thorlabs | LJ1695RM-A | CL2 |
1" square kinematic mount | Edmund Optics | 58-857 | For dichroic mirror mounting |
1" Threaded Cage Plate | Thorlabs | CP02 | For holding other lenses |
2" Achromatic doublet | Thorlabs | AC508-150-A-ML | L3 |
2" Achromatic doublet | Thorlabs | AC508-400-A-ML | L4 |
2" Threaded Cage Plate | Thorlabs | LCP01 | For holding L4 |
2" Threaded Cage Plate | Thorlabs | LCP01T | For holding L3 |
2% Bis Solution | Bio Rad | 64085292 | hydrogel component |
20 nm fluorescent beads | Thermo Fisher | F8782 | For testing imaging |
30 mm Cage Right-Angle Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | KCB1 | For objective & camera mounting |
30mm Cage System Iris | Thorlabs | CP20S | |
3-Axis NanoMax Stage | Thorlabs | MAX311D | |
40% Acrylamide Solution | Bio Rad | 64148001 | hydrogel component |
405 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-MLD | |
50x TAE buffer | Bio-Rad | 161-0743 | hydrogel component |
561 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-DPL | |
638 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-MLD | |
Ammonium persulfate | Sigma | A3678-25G | hydrogel component |
Beam alignment tool | custom made | ||
BNC terminal blocks | Natural Instruments | BNC-2110 | |
Cage plate with M9 x 0.5 internal threads | Thorlabs | CP1TM09 | For holding aspheric lens |
Cage System Rods | Thorlabs | SR series | |
Cell culture & smFISH | See a reference [11] | ||
Double side tape | Scotch | 515182 | Flow chamber |
Epoxy | Devcon | 14250 | Flow chamber |
Galvo mirror | Thorlabs | GVS211 | GM |
Galvo System Linear Power Supply | Thorlabs | GPS011 | |
Half wave plate | Thorlabs | WPH10M-405/561/633 | Power adjustment |
long-pass dichroic mirror | Chroma | T550lpxr | For combining lasers |
Microscope slides | Fisherbrand | 12549-3 | Flow chamber |
Mikroskopische Deckglaser | Hecht Assistent | 990/5024 | Flow chamber |
Mounted Frosted Glass Alignment Disk | Thorlabs | DG10-1500-H1-MD | For double pinhole system |
Mounted rochester aspheric lens | Thorlabs | A230TM-A | |
Multi-band dichroic mirror | Semrock | Di03-R405/488/561/635-t3 | DM; 3 mm thickness |
Multi-band filter | Semrock | FF01-446/523/600/677-25 | BF |
Multimode fiber | Thorlabs | M31L02 | MMF |
N,N,N',N'-tetramethyl ethylenediamine | Sigma | T7024-25ML | hydrogel component |
NI-DAQ board | Natural Instruments | PCI-6733 | |
Ø1" Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | KM100 | For holding mirrors |
Objective lens | Olympus | PLANAPO N 60X | 60X 1.45NA oil |
Pedestal Base Clamping Forks | Newport | 9916 | |
Pedestal Pillar Posts | Thorlabs | RS1P8E | |
Piezo controller | Thorlabs | BPC303 | |
Polarized beam splitter | Thorlabs | PBS251 | For combining lasers |
RMS-SM1 adapter | Thorlabs | SM1A3TS | For objective lens |
Rod holder | custom made | ||
Rotation cage mount | Thorlabs | RSP1/CRM1/CRM1P | For HWP & cylindrical lens mounting |
sCMOS camera | Andor | Zyla-4.2P-CL10 | |
Shearing interferometer | Thorlabs | SI100 | Beam collimation test |
Single mode fiber | Thorlabs | P5-405BPM-FC-2 | SMF |
SM1 Lens Tubes | Thorlabs | SM1S25 | For double pinhole system |
SM1 Slotted Lens Tube | Thorlabs | SM1L30C | For double pinhole system |
Stage mount | custom made | ||
threaded fiber adapter | Thorlabs | SM1FC | |
Z-Axis Translation Mount | Thorlabs | SM1Z | Fiber coupling |