Une instruction détaillée est décrit comment construire un très inclinée a balayé le microscope de tuile (HIST) et son utilisation pour l’imagerie de la molécule unique.
Single-molecule imaging a grandement contribué à améliorer notre compréhension des mécanismes moléculaires dans les études biologiques. Toutefois, il a été difficile d’obtenir des images grands champ de vision, contraste élevé en épaisseur cellules et tissus. Ici, nous introduisons la tuile balayé très inclinée (HIST) microscopie qui surmonte ce problème. Une paire de lentilles cylindriques a été mis en place pour générer un faisceau d’excitation allongée qui a été analysé sur une vaste zone d’imagerie via un miroir galvanométrique rapide. Une configuration 4f était utilisée pour maintenir les composants optiques. Une caméra scientifique complémentaire métal-oxyde-semiconducteur détecté le signal de fluorescence et bloqué l’arrière-plan out-of-focus avec une fente confocale dynamique synchronisée avec le balayage du faisceau. Nous présentons une instruction étape par étape sur la construction du microscope HIST avec tous les composants de base.
Imagerie de fluorescence de la seule molécule joue un rôle important dans de nombreuses études biologiques qui révèlent des ultrastructures, la dynamique et la quantité des biomolécules1,2,3. Toutefois, il a été difficile à étudier seul les molécules à l’intérieur des cellules ou tissus. Microscopie confocale fournit haute sectionnement capacité4, il n’est pas adapté pour l’imagerie de la molécule unique en raison de grave Photoblanchiment de l’intensité d’excitation haute ou basse vitesse d’imagerie. Microscope Widefield utilise plus faible éclairage mais souffre d’un mauvais signal à fond ratio (SBR)5. Microscopie à lumière-feuille, en revanche, pourrait montrer bonnes coupes et Photoblanchiment faible6; Toutefois, l’ouverture numérique disponible (NA) est grandement limitée par l’exigence d’objectifs orthogonalement placé7. Sinon, il faut enlumineurs spéciale et échantillon chambres8,9.
Pour ces raisons, microscopie fiche optique fortement incliné et feuilleté (HILO) a été largement utilisée pour 3D simple-molécule d’imagerie10. Lorsqu’une poutre inclinée rencontre une interface de deux milieux (verre ou l’eau, par exemple), le faisceau est réfracté conformément à la loi de Snell-Descartes. Ce qui est important, le faisceau réfracté s’amincit, et son épaisseur est décrite comme dz = R/tan(θ) où R est le diamètre de la poutre inclinée et θ est l’angle de réfraction du faisceau transmis. Cette implémentation simple se traduit par une bonne capacité de coupe. Néanmoins, cette relation indique qu’un éclairage mince (c.-à-d., haute capacité sectionnement) requiert un petit R et/ou une grande θ. Par exemple, lorsque R = 20 µm et θ = 72 degrés, on peut obtenir dz = 6,5 µm. Puisqu’il n’y a une limite à l’augmentation de l’angle de réfraction pour image profondément à l’intérieur des cellules et éviter la réflexion interne totale, il y a un couplage fort de l’illumination de diamètre et l’épaisseur de la poutre. Pour cette raison, l’imagerie HILO montre une relativement faible champ de vision (FOV) qui limite grandement ses applications en imagerie multicellulaire.
Récemment, nous avons surmonté ce problème en microscopie de tuile balayé très inclinée (HIST) où le champ de vision est découplé de l’épaisseur du faisceau d’un moyen très simple de11. Tout d’abord, un faisceau allongé dans un seul sens est généré grâce à une paire de lentilles cylindriques. Ce faisceau, qualifié comme une tuile, produit une illumination mince avec dz ~ 4 µm, tandis que son champ de vision est 130 x 12 µm2. Ensuite, la tuile est balayée de l’échantillon à l’aide d’un miroir galvanométrique tournant. Pendant ce temps, l’image de fluorescence est enregistrée sur un appareil scientifique complémentaire métal-oxyde-semiconducteur (sCMOS) qui filtre efficacement out-of-focus fond en opérant en mode obturateur roulant qui sert de détection fente confocal accordable. De cette manière, HIST microscopie permet l’imagerie seule molécule avec un plus grand champ de vision (~ 130 x 130 µm2) et un éclairage plus mince que l’imagerie HILO. Nous avons appliqué cette nouvelle technique pour détecter l’ARN transcrits avec une seule sonde dans les cellules ou avec quelques sondes dans les tissus cérébraux de souris, qui a un potentiel important pour l’étude des maladies et l’expression des gènes d’imagerie. Contrairement aux autres approches, HIST emploie seulement un objectif unique ouverture numérique élevée sans un illuminateur supplémentaire ou objectifs de détection à distance et est entièrement compatible avec les microscopes inversés. Ces avantages ainsi qu’un grand champ de vision et un contraste élevé fera HIST microscopie un outil important en biologie et en médecine. Nous présentons des instructions détaillées concernant l’instrumentation du microscope HIST et comment faire pour tester et calibrer ses performances comme ci-dessous.
Il y a deux étapes cruciales dans le présent protocole. Le premier est le positionnement correct de L4 à l’étape 3.3, veiller à ce que le faisceau incident traverse le centre de la lentille et un modèle de disque aéré parfait est formé sur le plafond. La position de L4 détermine le placement de tous les autres composants optiques, y compris les M5, L2, L3 et GM. La deuxième étape critique est le processus de synchronisation. Pour rejeter le hors contexte de la mise au point, les pixels actifs dont une détection efficace la largeur est égale à la largeur de la tuile doivent être synchronisés avec le balayage du faisceau. Par conséquent, il est nécessaire de mesurer la largeur de l’éclairage efficace d’un faisceau de carreaux (point 5.6) et paramètres de la caméra fixe en conséquence à l’étape 6.4.
Lorsque l’imagerie avec très grand champ de vision, la méthode présentée montre une formation accrue d’un côté par rapport à l’autre côté. Ceci est attribué à des angles légèrement modifiées de l’éclairement à différentes positions d’imagerie. Mise en œuvre d’un second miroir galvanométrique au lieu de M5 atténue ce problème comme l’a démontré avant en ajustant simultanément la position et la numérisation de l’angle11. Au lieu de doublets achromatiques sur étagère, un objectif de balayage télécentrique sera également utile. Toutefois, pour une superficie de l’imagerie < 8 080 µm2, galvo seul miroir de balayage était suffisant. La microscopie HIST a une limite de la profondeur d’imagerie, cependant, il est en mesure d’obtenir un bon SBR lors d’imagerie jusqu’à ~ 15 µm avec un faisceau de tuile 12 µm et 1,45 NA huile d’immersion objectif11.
Dans ce protocole, nous avons utilisé le ratio de compression de faisceau de 8 pour faire une poutre de la tuile. Un éclairage plus mince peut être utilisé dans la microscopie HIST pour atteindre SBR plus élevé, qui pourrait être puissant pour imagerie11des tissus de molécules simples. Toutefois, dans ce cas, effet de Photoblanchiment devrait considérer une intensité d’excitation accrue tandis que le taux de compression actuel faisceau montrait Photoblanchiment réduit en imagerie 3D par rapport aux Epi11. Par rapport aux microscopes de lumière-feuille avec deux objectifs placés perpendiculairement, HIST microscopie est simple à implémenter et compatible avec les préparations classiques. Le SBR renforcée et un grand champ de vision de microscopie HIST convient pour étudier les interactions et dynamique des biomolécules unique en plusieurs cellules et peut être utilisé également en imagerie de super-résolution et suivi des molécules simples.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par la Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) (HR00111720066) et la National Science Foundation (NSF) (1805200). Nous remercions Michael Serge dans Andor Technology généreusement prêté la caméra sCMOS.
1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-060-A-ML | Collimator |
1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-100-A-ML | L1,L2 |
1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-300-A-ML | TL |
1" Broadband Dielectric Mirrors | Thorlabs | BB1-E02-10 | M1~M7 |
1" Cylindrical Lenses | Thorlabs | LJ1363RM-A | CL1 |
1" Cylindrical Lenses | Thorlabs | LJ1695RM-A | CL2 |
1" square kinematic mount | Edmund Optics | 58-857 | For dichroic mirror mounting |
1" Threaded Cage Plate | Thorlabs | CP02 | For holding other lenses |
2" Achromatic doublet | Thorlabs | AC508-150-A-ML | L3 |
2" Achromatic doublet | Thorlabs | AC508-400-A-ML | L4 |
2" Threaded Cage Plate | Thorlabs | LCP01 | For holding L4 |
2" Threaded Cage Plate | Thorlabs | LCP01T | For holding L3 |
2% Bis Solution | Bio Rad | 64085292 | hydrogel component |
20 nm fluorescent beads | Thermo Fisher | F8782 | For testing imaging |
30 mm Cage Right-Angle Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | KCB1 | For objective & camera mounting |
30mm Cage System Iris | Thorlabs | CP20S | |
3-Axis NanoMax Stage | Thorlabs | MAX311D | |
40% Acrylamide Solution | Bio Rad | 64148001 | hydrogel component |
405 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-MLD | |
50x TAE buffer | Bio-Rad | 161-0743 | hydrogel component |
561 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-DPL | |
638 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-MLD | |
Ammonium persulfate | Sigma | A3678-25G | hydrogel component |
Beam alignment tool | custom made | ||
BNC terminal blocks | Natural Instruments | BNC-2110 | |
Cage plate with M9 x 0.5 internal threads | Thorlabs | CP1TM09 | For holding aspheric lens |
Cage System Rods | Thorlabs | SR series | |
Cell culture & smFISH | See a reference [11] | ||
Double side tape | Scotch | 515182 | Flow chamber |
Epoxy | Devcon | 14250 | Flow chamber |
Galvo mirror | Thorlabs | GVS211 | GM |
Galvo System Linear Power Supply | Thorlabs | GPS011 | |
Half wave plate | Thorlabs | WPH10M-405/561/633 | Power adjustment |
long-pass dichroic mirror | Chroma | T550lpxr | For combining lasers |
Microscope slides | Fisherbrand | 12549-3 | Flow chamber |
Mikroskopische Deckglaser | Hecht Assistent | 990/5024 | Flow chamber |
Mounted Frosted Glass Alignment Disk | Thorlabs | DG10-1500-H1-MD | For double pinhole system |
Mounted rochester aspheric lens | Thorlabs | A230TM-A | |
Multi-band dichroic mirror | Semrock | Di03-R405/488/561/635-t3 | DM; 3 mm thickness |
Multi-band filter | Semrock | FF01-446/523/600/677-25 | BF |
Multimode fiber | Thorlabs | M31L02 | MMF |
N,N,N',N'-tetramethyl ethylenediamine | Sigma | T7024-25ML | hydrogel component |
NI-DAQ board | Natural Instruments | PCI-6733 | |
Ø1" Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | KM100 | For holding mirrors |
Objective lens | Olympus | PLANAPO N 60X | 60X 1.45NA oil |
Pedestal Base Clamping Forks | Newport | 9916 | |
Pedestal Pillar Posts | Thorlabs | RS1P8E | |
Piezo controller | Thorlabs | BPC303 | |
Polarized beam splitter | Thorlabs | PBS251 | For combining lasers |
RMS-SM1 adapter | Thorlabs | SM1A3TS | For objective lens |
Rod holder | custom made | ||
Rotation cage mount | Thorlabs | RSP1/CRM1/CRM1P | For HWP & cylindrical lens mounting |
sCMOS camera | Andor | Zyla-4.2P-CL10 | |
Shearing interferometer | Thorlabs | SI100 | Beam collimation test |
Single mode fiber | Thorlabs | P5-405BPM-FC-2 | SMF |
SM1 Lens Tubes | Thorlabs | SM1S25 | For double pinhole system |
SM1 Slotted Lens Tube | Thorlabs | SM1L30C | For double pinhole system |
Stage mount | custom made | ||
threaded fiber adapter | Thorlabs | SM1FC | |
Z-Axis Translation Mount | Thorlabs | SM1Z | Fiber coupling |