En onkogen Hepatocyte-induceret Ortotopisk muse model af Hepatocellulær cancer, der opstår i fastsættelsen af hepatisk inflammation og fibrose

Summary

Her beskriver vi udviklingen af en klinisk relevant murine model af leverkræft rekapitulere de typiske immun funktioner af hepatocellulær cancer (HCC).

Abstract

Fraværet af en klinisk relevant dyremodel, der adresserer de typiske immun karakteristika ved hepatocellulær cancer (HCC), har i væsentlig grad forhindret elucidationen af de underliggende mekanismer og udviklingen af innovative immunterapeutiske strategier. For at udvikle en ideel dyremodel til at rekapitulere Human HCC, immunkompetente mandlige C57BL/6J mus først modtage en Carbon tetrachlorid (CCl₄) injektion for at fremkalde lever fibrose, derefter modtage histologisk-normale onkogene hepatocytter fra unge mandlige SV40 T antigen (TAg)-Transgene mus (MTD2) ved intra-splenisk (ISPL) inokulation. Androgen genereret i recipient mandlige mus i puberteten indleder TAg udtryk under kontrol af en lever-specifik promotor. Som et resultat, de overførte hepatocytter bliver kræftceller og danne tumor masser i fastsættelsen af lever fibrose/cirrhose. Denne nye model efterligner Human HCC initiering og progression i forbindelse med lever fibrose/cirrhose og afspejler de mest typiske træk ved humant HCC herunder immun dysfunktion.

Introduction

Hepatocellulær cancer (HCC) er den mest hastigt voksende type kræft i USA (US)^1,2,3. Hvert år diagnosticeres ca. 850.000 nye tilfælde^4,5 og 700.000 patienter dør af denne dødelige^{sygdom 6,7,8,9,10} , hvilket gør den til den næsthøjeste årsag til kræft relateret død verden over. Administration af HCC omfatter kirurgisk resektion, transplantation, ablation, chemoembolization eller systemiske terapier, såsom sorafenib¹¹. Tidlig diagnose og administration med kirurgisk resektion eller transplantation har den højeste samlede overlevelsesfordel⁴. Desværre, de fleste patienter til stede på et senere tidspunkt og kræver administration med ablation, chemoembolization eller sorafenib¹². Sorafenib, en receptor tyrosinkinasehæmmer (RTKI), blev godkendt af Food and Drug Administration i 2008 som den eneste systemiske lægemiddelbehandling, der var tilgængelig til behandling af inoperabel HCC. Selv om stoffet kun giver en beskeden stigning i den samlede overlevelse, fra 7,9 til 10,7 måneder¹³, det gav en ny terapeutisk strategi, der kunne udnyttes til at forvalte HCC.

Manipulation af immunsystemet for at eliminere etablerede kræftformer er et hastigt voksende felt inden for kræftforskning¹⁴. Immun check point studier har betydeligt avanceret immunotherapeutisk lægemiddeludvikling i kræftbehandling^15,16. FDA godkendte brugen af antistoffer (ABS) mod cytotoksisk T-lymfocyt antigen 4 (CTLA-4), programmeret celledød protein 1 (PD-1) og dets ligand PD-L1 til behandling af melanom, lungekræft, hoved-og nakke kræft og blærecancer^{17, 18 , 19 , 20}. kliniske forsøg med monoterapi eller kombinationsbehandling med et eller flere antistoffer mod PD-1, PD-L1 eller ctla-4 til behandling af avanceret HCC er i gang^21,22,23og nogle forsøg har vist gunstige resultater. I 2017, FDA givet fremskyndet godkendelse for anti-PD-1 antistof til behandling af HCC patienter, der er resistens over for sorafenib, men den samlede responsrate af denne behandling er kun 14,3%. Andre strategier er ikke blevet oversat til klinisk praksis på dette tidspunkt^24,25. Overvinde tumor-induceret dyb immuntolerance for at forbedre immun check point terapi²⁶; forudsigelse af effekten af immun check point terapi; forebyggelse af immunrelaterede uønskede hændelser optimering af administrationsvej, dosering og hyppighed; og finde effektive kombinationer af terapier^27,28,29 alle forbliver yderst udfordrende opgaver.

Der er flere konventionelle tilgange, der anvendes til at inducere HCC i musemodeller i øjeblikket og udnyttes afhængigt af investigators særlige forskning spørgsmål³⁰. Kemisk inducerede HCC-musemodeller med genotoksiske forbindelser efterligner skade forårsagede maligniteter. Xenograft-modeller gennem enten ektopisk eller ortotopisk implantation af HCC-cellelinjer er velegnede til lægemiddel screening. En række genetisk modificerede mus er blevet konstrueret til at undersøge Patofysiologi af HCC. Transgene mus, der udtrykker virale gener, onkogener og/eller vækstfaktorer gør det muligt at identificere veje involveret i hepatocarcinogenese. På grund af iboende begrænsninger, kan disse modeller ikke rekapitulere de typiske immun karakteristika, der ses i human HCC, som har betydeligt hæmmet belysning af de underliggende mekanismer og udvikling af innovative immunotherapeutiske strategier^{14 ,15}. Vi har for nylig skabt en klinisk relevant murine model. Denne roman model ikke kun efterligner Human HCC initiering og progression, men også afspejler de fleste typiske træk ved sygdomme hos mennesker, herunder immun dysfunktion. Vi har karakteriseret dets biologiske og immunologiske egenskaber. Ved at udnytte denne nye model har vi undersøgt forskellige immun terapeutiske strategier til behandling af HCC^{31,32,33,34,35,36, 37}. denne unikke platform giver os mulighed for at studere mekanismer af tumor-induceret immunotolerance og udvikle proof-of-koncept terapeutiske strategier for HCC mod eventuel klinisk oversættelse.

Protocol

Bemærk: alle de procedurer, herunder dyr emner er blevet godkendt af IACUC på University of Missouri. Alle mus fik human behandling i henhold til de kriterier, som er skitseret i “vejledning i pleje og anvendelse af forsøgsdyr”. Følgende procedure for celle isolering og inokulation bør udføres i en hætte. Alle udøvende kunstnere bør bære standard personlige værnemidler til håndtering af mus og væv. 1. induktion af lever fibrose og cirrhose med IP-injektion af Tetrachlorid (CCl4…

Representative Results

Onkogene hepatocytter isoleret fra TAg-Transgene mus (figur 2) blev seedet i leveren af vilde type mus ved intra-splenisk injektion (figur 3). Den transplanterede hepatocytter succesfuldt og pålideligt voksede ortotopisk HCC tumorer (figur 4) med tumor specifikke antigen SV40 TAg (figur 5) i indstillingen af hepatisk inflammation og fibrose (figur 1). <img alt="Figure 1" class…

Discussion

Med denne protokol har vi etableret en pålidelig og reproducerbar murine model af HCC, der efterligner Human HCC initiering og progression. Klinisk, mange risikofaktorer successivt inducere leverskade, lever fibrose, cirrhose og den sidste fase af HCC. I vores protokol, IP injektion af CCL₄ bruges til først at producere lever fibrose i vildtype mus, som gør det muligt for de efterfølgende onkogene hepatocytter til dannelse af tumorer i fastsættelsen af lever fibrose. Vi fandt, at tumordannelse forekom mes…

Materials

Anesthesia machine	VETEQUIP	IMPAC6	anesthesia machine for surgery
Butterfly needle	BD	8122963	Needle used for liver perfusion
C57BL/6 mice	Jackson Lab	000664	mice used in prototol
Carprofen	CRESCENT CHEMICAL	20402	carprofen for pain release
Cell Strainer	CORNING	REF 431751	Cell strainer, 70µm, for hepatocytes isolation
Centrifuge	Beckman Coulter	Allegra X-30R	centrifuge for cell isolation
Clips	Teleflex Medical	REF 523700	Titanium Clips for spleen
Microscope	Zeiss	Primovert	microscope for cell observation
Mtd2 mice	N/A		Gift from Dr. William A Held at roswell Park Cancer Institute in 2002, maintained in our lab
Needle	BD	REF 305109	BD precisionglide needle, 27G x 1/2 (0.4mm x 13mm)
Suture	ETHICON	J303H	coated VICRYL suture
SV40 T Ag antibody	Abcam	ab16879	anti-SV40 T-antigen antibody for IHC
Syringe	BD	REF 309626	1 mL TB syringe for cell injection
Trypan blue	SIGMA	T 8154	Trypan blue solution for cell viability test
Wound clips	Reflex	reflex9, Part. No. 201-1000	stainless steel wound clips for wound close