JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Cancer Research

Hepatik İnflamasyon ve Fibrozis Ortamında Ortaya Çıkan Hepatosellüler Kanserin Onkojenik Hepatositkaynaklı Ortotopik Fare Modeli

Published: September 12, 2019
doi:
10.3791/59368
, , , , , ,
1Department of Surgery,University of Missouri-Columbia, 2Ellis Fischel Cancer Center,University of Missouri-Columbia, 3Molecular Microbiology and Immunology,University of Missouri-Columbia

Summary

Burada, hepatosellüler kanserin (HCC) tipik bağışıklık özelliklerini özetlemek için karaciğer kanserinin klinik olarak ilgili bir murine modelinin gelişimini açıklıyoruz.

Abstract

Hepatosellüler kanserin (HCC) tipik bağışıklık özelliklerini ele alan klinik olarak alakalı bir hayvan modelinin olmaması, altta yatan mekanizmaların açıklanmasını ve yenilikçi immünterapötik stratejilerin geliştirilmesini önemli ölçüde engellemiştir. İnsan HCC’yi recapite eden ideal bir hayvan modeli geliştirmek için, immün omübusta erkek C57BL/6J fareler önce karaciğer fibrozisini tetiklemek için karbon tetraklorür (CCl4)enjeksiyonu alır, sonra genç erkekten histolojik olarak normal onkojenik hepatosit alırlar SV40 T antijeni (TAg)-transgenik fareler (MTD2) intra-dalak (ISPL) aşısı ile. Ergenlik te alıcı erkek farelerde üretilen Androjen karaciğere özgü bir organizatörün kontrolü altında TAg ifadesini başlatır. Sonuç olarak, transfer hepatositler kanser hücresi haline gelir ve karaciğer fibrozis / siroz ayarında tümör kitleleri oluşturur. Bu yeni model karaciğer fibrozis / siroz bağlamında insan HCC inisiyasyon ve ilerleme taklit ve bağışıklık disfonksiyonu da dahil olmak üzere insan HCC en tipik özelliklerini yansıtır.

Introduction

Hepatosellüler kanser (HCC) Amerika Birleşik Devletleri’nde kanser in en hızlı artan türüdür (ABD)1,2,3. Her yıl, yaklaşık 850.000 yeni olgu teşhis edilir4,5 ve 700,000 hasta bu ölümcül hastalıktan ölür6,7,8,9,10 , kansere bağlı ölüm dünya çapında ikinci en yüksek nedeni yapma. HCC’nin yönetimi cerrahi rezeksiyon, transplantasyon, ablasyon, kemoembolizasyon veya sorafenib11gibi sistemik tedavileri içerir. Cerrahi rezeksiyon veya transplantasyon ile erken tanı ve tedavi en yüksek genel sağkalım avantajına sahiptir4. Ne yazık ki, hastaların çoğunluğu daha sonraki bir aşamada mevcut ve ablasyon, kemoembolizasyon veya sorafenib12ile yönetim gerektirir. Sorafenib, bir reseptör tirozin kinaz inhibitörü (RTKI), Gıda ve İlaç İdaresi tarafından 2008 yılında rezeke edilemeyen HCC tedavisinde mevcut tek sistemik ilaç tedavisi olarak onaylanmıştır. İlaç sadece genel sağkalım mütevazı bir artış sağlar rağmen, 7.9 için 10.7 ay13,HCC yönetmek için kullanılabilir yeni bir tedavi stratejisi sağladı.

Kurulan kanserleri ortadan kaldırmak için bağışıklık sistemini manipüle kanser araştırma hızla büyüyen bir alandır14. Bağışıklık kontrol noktası çalışmaları kanser tedavisinde önemli ölçüde ileri immünterapötik ilaç gelişimi var15,16. FDA sitotoksik T-lenfosit antijen4 (CTLA-4), programlanmış hücre ölüm proteini 1 (PD-1) ve melanom tedavisi için ligand PD-L1 karşı antikorların (Abs) kullanımını onayladı, akciğer kanseri, baş ve boyun kanseri, ve mesane kanseri17, 18.000 , 19.09.20 , 20. Gelişmiş HCC tedavisi için PD-1, PD-L1 veya CTLA-4 karşı bir veya birden fazla antikor kullanılarak monoterapi veya kombinasyon tedavisi klinik çalışmalar devam etmektedir21,22,23, ve bazı denemeler olumlu sonuçlar göstermiştir. 2017 yılında FDA, sorafenib direnci olan HCC hastalarını tedavi etmek için anti-PD-1 antikor için hızlandırılmış onay verdi, ancak bu tedavinin genel yanıt oranı sadece %14,3’tür. Diğer stratejiler şu anda klinik uygulamaya çevrilmemiştir24,25. Bağışıklık kontrol noktası tedavisi geliştirmek için tümör kaynaklı derin bağışıklık toleransı üstesinden26; immün kontrol noktası tedavisinin etkinliğini tahmin etmek; bağışıklık la ilgili advers olayları önlemek; yönetim rotasını, dozajı ve sıklığını optimize etmek; vetedavilerinetkili kombinasyonları bulma 27,28,29 tüm son derece zorlu görevleri kalır.

Şu anda fare modellerinde HCC indüklemek için kullanılan çeşitli geleneksel yaklaşımlar vardır ve araştırmacının özel araştırma soru30bağlı olarak kullanılmaktadır. Kimyasal olarak indüklenen HCC fare modelleri ve genotoksik bileşikler yaralanmaya bağlı maligniteyi taklit eder. HCC hücre hatlarının ektopik veya ortotopik implantasyonu ile ksenogreft modelleri ilaç taraması için uygundur. Genetiği değiştirilmiş fareler bir dizi HCC patofizyolojisi araştırmak için yapılmıştır. Viral genleri, onkogenleri ve/veya büyüme faktörlerini ifade eden transgenik fareler hepatokarsinogenezde yer alan yolların belirlenmesine olanak sağlar. Doğal sınırlamalar nedeniyle, bu modeller insan HCC görülen tipik bağışıklık özellikleri recapitulate yok, hangi önemli ölçüde altta yatan mekanizmaların açıklanması ve yenilikçi immünoterapötik stratejilerin geliştirilmesi engelvardır14 ,15. Yakın zamanda klinik olarak uygun bir murine modeli oluşturduk. Bu yeni model sadece insan HCC inisiyasyon ve ilerleme taklit değil, aynı zamanda bağışıklık disfonksiyonu da dahil olmak üzere insan hastalığının en tipik özelliklerini yansıtır. Biyolojik ve immünolojik özelliklerini karakterize ettik. Bu yeni model yararlanarak, biz HCC31,32,33,34,35,36 , tedavi etmek için çeşitli immünoterapötik stratejiler araştırdık 37– Bu benzersiz platform bize tümör kaynaklı immünotolerans mekanizmaları çalışma ve nihai klinik çeviri doğru HCC için kanıt-of-kavram tedavi stratejileri geliştirmek için izin verir.

Protocol

NOT: Hayvan konuları da dahil olmak üzere tüm prosedür Missouri Üniversitesi’nde IACUC tarafından onaylanmıştır. Tüm fareler “Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu”nda belirtilen kriterlere göre insancıl bakım almıştır. Hücre izolasyonu ve aşılama için aşağıdaki prosedür bir başlık içinde yapılmalıdır. Tüm sanatçılar fare ve doku kullanımı için standart kişisel koruyucu ekipman giymelidir. 1. Karbon Tetraklorür IP Enjeksiyonu ile Kara…

Representative Results

TAg-transgenik farelerden izole edilen onkojenik hepatositler(Şekil 2)intra-dalak enjeksiyonu ile yabani tip farelerin karaciğerinde tohumlandılar (Şekil 3). Nakledilen hepatositler hepatik inflamasyon ve fibrozis ortamında tümöre özgü antijen SV40 TAg(Şekil 5)ile başarılı ve güvenilir bir şekilde büyümüş ortotopik HCC tümörleri(Şekil 4)(Şekil 1). <img al…

Discussion

Bu protokol ile, insan HCC inisiyasyon ve ilerlemesini taklit eden güvenilir ve tekrarlanabilir bir hcc murine modeli oluşturduk. Klinik olarak, birçok risk faktörü art arda karaciğer hasarı, karaciğer fibrozisi, siroz ve HCC son aşaması neden. Protokolümüzde, CCl4 IP enjeksiyonu ilk olarak yabani tip farelerde karaciğer fibrozisi üretmek için kullanılır, bu da sonraki onkojenik hepatositlerin karaciğer fibrozisi ortamında tümörleri oluşturmasına olanak sağlar. CCl4 tedavisin…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma NIH/NCI R01 CA164335-01A1 (K. F. Staveley-O’Carroll, PI) ve NIH/NCI R01CA208396 (Mark Kester, Guangfu Li, Kevin F. Staveley-O’Carroll) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Anesthesia machine VETEQUIP IMPAC6 anesthesia machine for surgery
Butterfly needle BD 8122963 Needle used for liver perfusion
C57BL/6 mice Jackson Lab 000664  mice used in prototol
Carprofen CRESCENT CHEMICAL 20402 carprofen for pain release
Cell Strainer  CORNING REF 431751 Cell strainer, 70µm, for hepatocytes isolation
Centrifuge Beckman Coulter Allegra X-30R centrifuge for cell isolation
Clips  Teleflex Medical REF 523700 Titanium Clips for spleen
Microscope Zeiss Primovert  microscope for cell observation
Mtd2 mice N/A Gift from Dr. William A Held at roswell Park Cancer Institute in 2002, maintained in our lab
Needle BD REF 305109 BD precisionglide needle, 27G x 1/2 (0.4mm x 13mm)
Suture ETHICON J303H coated VICRYL suture
SV40 T Ag antibody Abcam ab16879 anti-SV40 T-antigen antibody for IHC
Syringe BD REF 309626 1 mL TB syringe for cell injection
Trypan blue SIGMA T 8154 Trypan blue solution for cell viability test
Wound clips Reflex reflex9, Part. No. 201-1000 stainless steel wound clips for wound close
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. O’Connor, S., Ward, J. W. Hepatocellular carcinoma – United States. Morbidity and Mortality Weekly Report. 59, 517-520 (2010).
  2. Petrick, J., Kelly, S., Altekruse, S., McGlynn, K., Rosenberg, P. Future of Hepatocellular Carcinoma Incidence in the United States Forecast Through 2030. Journal of clinical oncology: official journal of the American Society of Clinical Oncology. 34, 1787-1794 (2016).
  3. Greten, T., Lai, C., Li, G., Staveley-O’Carroll, K. Targeted and Immune-based Therapies for Hepatocellular Carcinoma. Gastroenterology. 156, 510-524 (2019).
  4. Llovet, J., Zucman-Rossi, J., Pikarsky, E., Sangro, B., Schwartz, M., Sherman, M., Gores, G. Hepatocellular Carcinoma. Nature reviews. Disease primers. 2, 16018 (2016).
  5. Ding, X., et al. Precision medicine for hepatocellular carcinoma: driver mutations and targeted therapy. Oncotarget. 8, 55715-55730 (2017).
  6. Colombo, M., Maisonneuve, P. Controlling liver cancer mortality on a global scale: still a long way to go. Journal of Hepatology. 67, 216-217 (2017).
  7. Llovet, J., Burroughs, A., Bruix, J. Hepatocellular carcinoma. Lancet. 362, 1907-1917 (2003).
  8. Parkin, D., Bray, F., Ferlay, J., Pisani, P. Estimating the world cancer burden: Globocan 2000. International Journal of Cancer. 94, 153-156 (2001).
  9. Thomas, M., Zhu, A. Hepocellular carcinoma: the need for progress. Journal of Clinical Oncology. 23, 2892-2899 (2005).
  10. Llovet, J., Bruix, J. Molecular targeted therapies in hepatocellular carcinoma. Hepatology. 48, 1312-1327 (2008).
  11. Bruix, J., Sherman, M. Management of hepatocellular carcinoma: an update. Hepatology. 53, 1020-1022 (2011).
  12. Pang, T., Lam, V. Surgical management of hepatocellular carcinoma. World Journal of Hepatology. 7, 245-252 (2015).
  13. Llovet, J., et al. Design and endpoints of clinical trials in hepatocellular carcinoma. Journal of the National Cancer Institution. 100, 698-711 (2008).
  14. Mueller, K. Cancer immunology and immunotherapy. Realizing the promise. Introduction. Science. 348, 54-55 (2015).
  15. Gajewski, T., Schreiber, H., Fu, Y. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nature Immunology. 14, 1014-1022 (2013).
  16. Ribas, A., Wolchok, J. Combining cancer immunotherapy and targeted therapy. Current Opinion in Immunology. 25, 291-296 (2013).
  17. Postow, M., Callahan, M., Wolchok, J. Immune checkpoint blockade in cancer therapy. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 33, 1974-1982 (2015).
  18. Gao, J., et al. VISTA is an inhibitory immune checkpoint that is increased in ipilimumab therapy in patients with prostate cancer. Nature Medicine. 23, 551-555 (2017).
  19. Hahn, A., Gill, D., Pal, S., Agarwal, N. The future of immune checkpoint cancer therapy after PD-1 and CTLA-4. Immunotherapy. 9, 681-692 (2017).
  20. Remon, J., Besse, B. Immune checkpoint inhibitors in first-line therapy of advanced non-small cell lung cancer. Current Opinion in Oncology. 29, 97-104 (2017).
  21. Kudo, M. Immune checkpoint blockade in hepatocellular carcinoma: 2017 update. Liver Cancer. 6, 1-12 (2017).
  22. Kudo, M. Immune checkpoint inhibition in hepatocellular carcinoma: Basics and ongoing clinical trials. Oncology. 92, 50-62 (2017).
  23. Breous, E., Thimme, R. Potential of immunotherapy for hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology. 54, 830-834 (2011).
  24. Sprinzl, M., Galle, P. Facing the dawn of immunotherapy for hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology. 59, 9-10 (2013).
  25. Liu, D., Staveley-O’Carroll, K., Li, G. Immune-based therapy clinical trials in hepatocellular carcinoma. Journal of Clinical Cell Immunology. 6, 376 (2015).
  26. Greten, T., Wang, X., Korangy, F. Current concepts of immune based treatments for patients with HCC: from basic science to novel treatment approaches. Gut. 64, 842-848 (2015).
  27. Koster, B., de Gruijl, T., van den Eertwegh, A. Recent developments and future challenges in immune checkpoint inhibitory cancer treatment. Current Opinion in Oncology. 27, 482-488 (2015).
  28. Johnson, D., Sullivan, R., Menzies, A. Immune checkpoint inhibitors in challenging populations. Cancer. 123, 1904-1911 (2017).
  29. Li, H., et al. Programmed cell death-1 (PD-1) checkpoint blockade in combination with an mTOR inhibitor restrains hepatocellular carcinoma growth induced by hepatoma cell-intrinsic PD-1. Hepatology. 66, 1920-1933 (2017).
  30. Heindryckx, F., Colle, I., van Vlierberghe, H. Experimental mouse models for hepatocellular carcinoma research. International Journal of Experimental Pathology. 90, 367-386 (2009).
  31. Qi, X., et al. Development of inCVAX, in situ cancer vaccine, and its immune response in mice with hepatocellular cancer. Journal of Clinical and Cellular Immunology. 7, 438 (2016).
  32. Qi, X., et al. Development of a radiofrequency ablation platform in a clinically relevant murine model of hepatocellular cancer. Cancer Biology and Therapy. 16, 1812-1819 (2015).
  33. Liu, D., et al. Sunitinib represses regulatory T cells to overcome immunotolerance in a murine model of hepatocellular cancer. Oncoimmunology. 7, 1372079 (2017).
  34. Staveley-O’Carroll, K., et al. In vivo ligation of CD40 enhances priming against the endogenous tumor antigen and promotes CD8+ T cell effector function in SV40 T antigen transgenic mice. Journal of Immunology. 171, 697-707 (2003).
  35. Avella, D., et al. Regression of established hepatocellular carcinoma is induced by chemoimmunotherapy in an orthotopic murine model. Hepatology. 55, 141-152 (2012).
  36. Li, G., et al. Successful chemoimmunotherapy against hepatocellular cancer in a novel murine model. Journal of Hepatology. 66, 75-85 (2017).
  37. Li, G., et al. Nanoliposome C6-ceramide increases the anti-tumor immune response and slows growth of liver tumors in ice. Gastroenterology. 154, 1024-1036 (2018).
  38. Held, W., et al. T antigen expression and tumorigenesis in transgenic mice containing a mouse major urinary protein/SV40 T antigen hybrid gene. EMBO Journal. 8, 183-191 (1989).
  39. Hanahan, D., Weinber, R. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).

Tags

Hepatocellular CancerOrthotopic Mouse ModelHepatic InflammationFibrosisTumor ImmunologyTumor MicroenvironmentLiver CancerTumor PerfusionCollagenase DigestionTumor Implantation
check_url/59368?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Qi, X., Schepers, E., Avella, D., Kimchi, E. T., Kaifi, J. T., Staveley-O’Carroll, K. F., Li, G. An Oncogenic Hepatocyte-Induced Orthotopic Mouse Model of Hepatocellular Cancer Arising in the Setting of Hepatic Inflammation and Fibrosis. J. Vis. Exp. (151), e59368, doi:10.3791/59368 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image