En onkogen hepatocyte-inducerad ortotopisk musmodell av Hepatocellulär cancer som uppkommer vid fastställandet av lever inflammation och fibros

Summary

Här beskriver vi utvecklingen av en kliniskt relevant murin modell av levercancer går igenom de typiska immun funktioner av Hepatocellulär cancer (HCC).

Abstract

Avsaknaden av en kliniskt relevant djurmodell som behandlar de typiska immun egenskaperna hos Hepatocellulär cancer (HCC) har påtagligt hämmad klargörande av de bakomliggande mekanismerna och utvecklingen av innovativa immunterapeutiska strategier. För att utveckla en idealisk djurmodell går igenom mänskliga HCC, immunkompetenta manliga C57BL/6j möss först få en koltetraklorid (CCL₄) injektion för att inducera leverfibros, sedan få histologiskt-normala onkogena hepatocyter från unga manliga SV40 T-antigen (TAg)-transgena möss (MTD2) genom intrasplenic (ISPL) inympning. Androgen genereras i mottagaren manliga möss vid puberteten initierar TAg uttryck under kontroll av en leverspecifik promotor. Som ett resultat, de överförda hepatocyterna blir cancerceller och bildar tumör massorna i inställningen av leverfibros/cirros. Denna roman modell härmar mänskliga HCC initiering och progression i samband med leverfibros/cirros och återspeglar de mest typiska dragen av mänskliga HCC inklusive immun dysfunktion.

Introduction

Hepatocellulär cancer (HCC) är den mest snabbt ökande typ av cancer i USA (USA)^1,2,3. Varje år diagnostiseras cirka 850 000 nya fall^4,5 och 700 000 patienter dör av denna dödliga sjukdom^6,7,8,9,10 , vilket gör den till den näst högsta orsaken till cancerrelaterad död i hela världen. Hantering av HCC inkluderar kirurgisk resektion, transplantation, ablation, kemoembolisering, eller systemiska terapier, såsom sorafenib¹¹. Tidig diagnostik och hantering med kirurgisk resektion eller transplantation har den högsta totala överlevnads förmånen⁴. Tyvärr, majoriteten av patienterna närvarande i ett senare skede och kräver hantering med ablation, chemoembolization eller sorafenib¹². Sorafenib, en receptortyrosinkinashämmare (RTKI), godkändes av Food and Drug Administration i 2008 som den enda systemiska läkemedelsbehandling som finns tillgänglig för behandling av icke-resektabel HCC. Även om drogen ger bara en blygsam ökning av den totala överlevnaden, från 7,9 till 10,7 månader¹³, det gav en ny terapeutisk strategi som skulle kunna utnyttjas för att hantera HCC.

Att manipulera immunförsvaret för att eliminera etablerade cancerformer är ett snabbt växande fält inom cancerforskningen¹⁴. Immun kontrollpunkt studier har betydligt avancerad immunterapeutisk läkemedelsutveckling i cancerbehandling^15,16. FDA godkände användningen av antikroppar (ABS) mot cytotoxiska T-lymfocytantigen 4 (CTLA-4), programmerad celldöd protein 1 (PD-1), och dess ligand PD-L1 för behandling av melanom, lungcancer, huvud-och halscancer, och cancer i urinblåsan^{17, 18 , 19 , 20}. kliniska prövningar med monoterapi eller kombinationsbehandling som använder en eller flera antikroppar mot PD-1, PD-L1 eller CTLA-4 för behandling av avancerad HCC pågår^21,22,23och prövningar har visat goda resultat. I 2017, FDA beviljade påskyndat godkännande för anti-PD-1 antikropp för att behandla HCC patienter, som är resistens mot sorafenib, men den totala responsfrekvensen av denna behandling är endast 14,3%. Andra strategier har inte översatts till klinisk praxis vid denna tid^24,25. Övervinna tumör-inducerad djup immuntolerans för att förbättra immun kontrollpunkt terapi²⁶; förutsäga effekten av immun kontrollpunkt terapi; förhindra immunrelaterade biverkningar; optimera administreringsväg, dosering, och frekvens; och hitta effektiva kombinationer av terapier^27,28,29 alla är fortfarande mycket utmanande uppgifter.

Det finns flera konventionella metoder som används för att inducera HCC i musmodeller för närvarande och utnyttjas beroende på prövarens särskild forskning fråga³⁰. Kemiskt inducerad HCC musmodeller med genotoxiska föreningar imitera skada-inducerad malignitet. Xenograft-modeller genom antingen ektopisk eller ortotopisk implantation av HCC-cellinjer lämpar sig för läkemedels screening. Ett antal genetiskt modifierade möss har konstruerats för att undersöka den patofysiologi av HCC. Transgena möss som uttrycker virala gener, onkogener och/eller tillväxtfaktorer gör det möjligt att identifiera vägar som är involverade i hepatocarcinogenes. På grund av inneboende begränsningar, dessa modeller inte recapitulate de typiska immun egenskaper ses i mänskliga HCC, som har signifikant hämmad klargörande av de bakomliggande mekanismerna och utvecklingen av innovativa immunterapeutiska strategier^{14 ,15}. Vi har nyligen skapat en kliniskt relevant murinmodell. Denna roman modell inte bara härmar mänskliga HCC initiering och progression, men återspeglar också de flesta typiska egenskaper hos mänskliga sjukdomar inklusive immun dysfunktion. Vi har karakteriserat dess biologiska och immunologiska egenskaper. Genom att utnyttja denna nya modell har vi undersökt olika immunterapeutiska strategier för att behandla HCC^{31,32,33,34,35,36, 37}. denna unika plattform ger oss möjlighet att studera mekanismer för tumörinducerad immunotolerans och att utveckla proof-of-Concept terapeutiska strategier för HCC mot eventuell klinisk översättning.

Protocol

Anmärkning: alla förfaranden inklusive djur försökspersoner har godkänts av IACUC vid University of Missouri. Alla möss fick Human vård enligt de kriterier som beskrivs i “handledning för vård och användning av försöksdjur”. Följande procedur för cell isolering och inympning ska utföras i en huva. Alla utövande konstnärer bör bära standard personlig skyddsutrustning för hantering av möss och vävnad. 1. induktion av leverfibros och cirros med IP-insprutning av koltetraklorid…

Representative Results

Onkogen hepatocyter isolerade från tagg-transgena möss (figur 2) var seedade i levern av vild typ möss genom intrasplenic injektion (figur 3). De transplanterade hepatocyterna framgångsrikt och tillförlitligt växte ortotopiska HCC tumörer (figur 4) med tumörspecifika antigen SV40 TAg (figur 5) vid fastställandet av leverinflammation och fibros (figur 1). <img alt="Figu…

Discussion

Med detta protokoll har vi etablerat en tillförlitlig och reproducerbar murina modell av HCC som härmar mänskliga HCC initiering och progression. Kliniskt, många riskfaktorer successivt inducera leverskada, leverfibros, cirros och den sista etappen av HCC. I vårt protokoll, IP injektion av CCl₄ används för att först producera leverfibros i vild typ möss, vilket gör att efterföljande onkogena hepatocyter att bilda tumörer i inställningen av leverfibros. Vi fann att tumör bildning inträffade mest …

Materials

Anesthesia machine	VETEQUIP	IMPAC6	anesthesia machine for surgery
Butterfly needle	BD	8122963	Needle used for liver perfusion
C57BL/6 mice	Jackson Lab	000664	mice used in prototol
Carprofen	CRESCENT CHEMICAL	20402	carprofen for pain release
Cell Strainer	CORNING	REF 431751	Cell strainer, 70µm, for hepatocytes isolation
Centrifuge	Beckman Coulter	Allegra X-30R	centrifuge for cell isolation
Clips	Teleflex Medical	REF 523700	Titanium Clips for spleen
Microscope	Zeiss	Primovert	microscope for cell observation
Mtd2 mice	N/A		Gift from Dr. William A Held at roswell Park Cancer Institute in 2002, maintained in our lab
Needle	BD	REF 305109	BD precisionglide needle, 27G x 1/2 (0.4mm x 13mm)
Suture	ETHICON	J303H	coated VICRYL suture
SV40 T Ag antibody	Abcam	ab16879	anti-SV40 T-antigen antibody for IHC
Syringe	BD	REF 309626	1 mL TB syringe for cell injection
Trypan blue	SIGMA	T 8154	Trypan blue solution for cell viability test
Wound clips	Reflex	reflex9, Part. No. 201-1000	stainless steel wound clips for wound close