تحليل لتطوير دائرة القلب أثناء Embryogenesis الماوس باستخدام كامل جبل ابيفلوريسسينسي
Summary
نقدم البروتوكولات لدراسة التنمية قلب الماوس باستخدام الفحص المجهري كله جبل ابيفلوريسسينت على الأجنة الماوس تشريح من البطين محددة حركة تحرير الكونغو-2v-تدتوماتو مراسل تدق في الفئران. هذا الأسلوب يسمح لنا بتصور كل مرحلة تشكيل البطين خلال الماوس قلب التنمية دون أساليب histochemical كثيفة العمالة مباشرة.
Abstract
والهدف من هذا البروتوكول وصف طريقة لتشريح الأجنة الماوس والتصور للدوائر البطين الجنينية الماوس أثناء تطوير قلب بطيني مراسل الفلورسنت محددة تدق في الفئران (الفئران حركة تحرير الكونغو-2v-تدتوماتو) باستخدام. قلب التنمية ينطوي على تشكيل أنبوب قلب خطي وأنبوب القلب حلقات أربعة الدائرة سيبتيشن. الغاية هي حفظت هذه العمليات المعقدة في جميع الفقاريات. قلب الجنينية الماوس تستخدم على نطاق واسع للدراسات الإنمائية القلب. نظراً لحجمها صغير للغاية، تشريح قلوب الجنينية الماوس غير تحديا من الناحية التقنية. وباﻹضافة إلى ذلك، التصور لتشكيل دائرة القلب وكثيراً ما يحتاج في الموقع التهجين، بيتا-جالاكتوسيداسي التلوين باستخدام لاكز مراسل الفئران، أو إيمونوستينينج من قلوب الجنينية مقطعة. هنا، نحن تصف كيفية تشريح قلوب الجنينية الماوس ومباشرة وضع تصور لتشكيل الدائرة البطين من حركة تحرير الكونغو-2v-تدتوماتو الفئران باستخدام الفحص المجهري كله جبل ابيفلوريسسينت. بهذه الطريقة، من الممكن مباشرة دراسة تشكيل أنبوب القلب وحلقات، وتشكيل الدائرة الأربع دون مزيد من التلاعب التجريبية للأجنة الماوس. على الرغم من أن يستخدم السطر الماوس في ضرب مراسل حركة تحرير الكونغو-2v-تدتوماتو في هذا البروتوكول كمثال، يمكن تطبيق هذا البروتوكول على خطوط الماوس المعدلة وراثيا مراسل الفلورسنت الخاصة بالقلب الأخرى.
Introduction
تشكيل الدائرة أثناء تطوير القلب عملية معقدة والانتقال عبر عدة مراحل الجنينية شكلياً مميزة1،2. شكل هلال من خلايا القلب السلف السكان يشكل أنبوب قلب خطي وثم يخضع لاستطالة وحلقات لتشكيل شكل دوامة قلب النامي. بعد عملية سيبتيشن، تتحول قلب النامية القلب أربع غرف. توقف أي من هذه العمليات ينتج عن تشوهات القلب التنموية. وبالتالي، من المهم فهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء تشكيل الدائرة أثناء تطوير القلب. وعلى الرغم من العديد من الدراسات السابقة في قلب التنمية، فهمنا لهذه العملية المعقدة لا يزال محدودا.
التهجين في الموقع، وإيمونوهيستوتشيميستري، وبيتا-جالاكتوسيداسي تلطيخ لاكز مراسل الفئران باستخدام قد استخدمت على نطاق واسع لدراسة تشكيل الدائرة خلال الماوس قلب التنمية بوصفها القلب محددة أو الدائرة جينات هيكلية محددة أو البروتينات (مثل Nppa، تفيي الانقلاب، Irx4، 2a حركة تحرير الكونغو وحركة تحرير الكونغو-2v)3،4،5،6،،من78،9،10. ومع ذلك، تتطلب هذه التجارب باستخدام أجنة الفأر قدرا كبيرا من الوقت والخبرة، نظراً لأن العديد من الخطوات التجريبية المختلفة يجب أن تكون إجراء التسلسل11. هنا، يمكننا وصف أسلوب الفحص المجهري ابيفلوريسسينت جبل كله بسيطة لتصور البطينين النامية استخدام الأجنة تشريح من حركة تحرير الكونغو-2v-تدتوماتو مراسل تدق في الفئران12. وميزة هذا الأسلوب مقارنة بالأساليب المستخدمة سابقا هو تجنب الخطوات التجريبية المعقدة التي غالباً ما قد تخلق اختلافات التجريبية. والغرض الرئيسي من هذا البروتوكول لوصف كيفية تشريح الأجنة الماوس وقلوب النامية ودراسة كل مرحلة من مراحل التنمية الدائرة القلب الماوس دون تجارب histochemical مملة. يمكن تطبيق هذا الأسلوب بسهولة لتقييم التنمية القلب باستخدام مختلف خطوط الماوس المعدلة وراثيا الأخرى العلامات المبكرة علامات القلب (مثلاً، Mesp1Cre: Rosa26EYFP13، Isl1Cre: Rosa26EYFP13،14من Hcn4H2BGFP، Hcn4Cre: روزا طن متري /mG14، Nkx2-5Cre: روزا mT/ملغ14، Hcn4-اجفب15، Isl1Cre: روزا mT/ملغ14، Nkx2.5Cre: Rosa26tdTomato15، والفئران16 TgMef2c-أف-التجارة والنقل).
Protocol
Representative Results
Discussion
الأسلوب الموصوفة هنا بسيط نسبيا لدراسة تطوير الدائرة البطين، دون إجراء تجارب ذات العمالة الكثيفة لتسمية الجينات الهيكلية البطين أو الخاصة بالقلب أو البروتينات. ومن ثم، يقلل هذا الأسلوب التقلبات التقنية التي تم العثور عليها غالباً في أقسام القلب إيمونوستينيد.
هناك اثنين م…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
أيد هذا العمل HL140264 R03 المعاهد الوطنية للصحة (ي. ج. N) وجيليد العلوم بحوث علماء البرنامج (ي. ج. N).
Materials
| dissecting microscope | Leica | MZ125 | |
| DNA ladder (100 bp) | Promega | G2101 | |
| epifluorescence dissecting microscope | Leica | M165 FC | |
| GoTaq Green master Mix | Promega | M712 | |
| PCR machine (master cycler) | Eppendorf | 6336000023 |
References
- Evans, S. M., Yelon, D., Conlon, F. L., Kirby, M. L. Myocardial lineage development. Circulation Research. 107 (12), 1428-1444 (2010).
- Paige, S. L., Plonowska, K., Xu, A., Wu, S. M. Molecular regulation of cardiomyocyte differentiation. Circulation Research. 116 (2), 341-353 (2015).
- Lee, K. J., et al. Myosin light chain-2 luciferase transgenic mice reveal distinct regulatory programs for cardiac and skeletal muscle-specific expression of a single contractile protein gene. Journal of Biological Chemistry. 267 (22), 15875-15885 (1992).
- Chen, J., et al. Selective requirement of myosin light chain 2v in embryonic heart function. Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 1252-1256 (1998).
- Ross, R. S., Navankasattusas, S., Harvey, R. P., Chien, K. R. An HF-1a/HF-1b/MEF-2 combinatorial element confers cardiac ventricular specificity and established an anterior-posterior gradient of expression. Development. 122 (6), 1799-1809 (1996).
- Christoffels, V. M., et al. Chamber formation and morphogenesis in the developing mammalian heart. Dev Biol. 223 (2), 266-278 (2000).
- Wu, S. P., et al. Atrial identity is determined by a COUP-TFII regulatory network. Developmental Cell. 25 (4), 417-426 (2013).
- Nelson, D. O., Jin, D. X., Downs, K. M., Kamp, T. J., Lyons, G. E. Irx4 identifies a chamber-specific cell population that contributes to ventricular myocardium development. Developmental Dynamics. 243 (3), 381-392 (2014).
- Bao, Z. Z., Bruneau, B. G., Seidman, J. G., Seidman, C. E., Cepko, C. L. Regulation of chamber-specific gene expression in the developing heart by Irx4. Science. 283 (5405), 1161-1164 (1999).
- Kubalak, S. W., Miller-Hance, W. C., O’Brien, T. X., Dyson, E., Chien, K. R. Chamber specification of atrial myosin light chain-2 expression precedes septation during murine cardiogenesis. Journal of Biological Chemistry. 269 (24), 16961-16970 (1994).
- Bardot, P., et al. The TAF10-containing TFIID and SAGA transcriptional complexes are dispensable for early somitogenesis in the mouse embryo. Development. 144 (20), 3808-3818 (2017).
- Zhang, Z., Nam, Y. J. Generation of MLC-2v-tdTomato knock-in reporter mouse line. Genesis. , (2018).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Liang, X., et al. HCN4 dynamically marks the first heart field and conduction system precursors. Circulation Research. 113 (4), 399-407 (2013).
- Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
- Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).
- O’Brien, T. X., Lee, K. J., Chien, K. R. Positional specification of ventricular myosin light chain 2 expression in the primitive murine heart tube. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5157-5161 (1993).
