Análise do desenvolvimento de câmara cardíaca durante a embriogênese de rato usando toda montagem de epifluorescência
Summary
Apresentamos os protocolos para examinar o desenvolvimento de coração de rato usando microscopia epifluorescente de montagem toda em embriões de rato dissecados de ventricular específica MLC-2v-tdTomato repórter bater-em ratos. Este método nos permite visualizar diretamente a cada estágio da formação ventricular durante o desenvolvimento de coração de rato sem métodos histoquímicos trabalho intensivos.
Abstract
O objetivo do presente protocolo é descrever um método para a dissecção de embriões do rato e visualização das câmaras ventriculares rato embrionária durante o desenvolvimento do coração usando ventricular repórter fluorescentes específicos bater-nos ratos (os ratos MLC-2v-tdTomato). Desenvolvimento do coração envolve uma formação de tubo linear de coração, o tubo de coração loop e quatro septation de câmara. Esses processos complexos são altamente conservados em todos os vertebrados. O coração embrionário de rato tem sido amplamente utilizado para estudos do desenvolvimento de coração. No entanto, devido ao seu tamanho extremamente pequeno, dissecar corações embrionárias de rato é tecnicamente desafiador. Além disso, visualização da formação de câmara cardíaca muitas vezes precisa de hibridação in situ, beta-galactosidase coloração usando ratos de repórter LacZ, ou imunocoloração de corações embrionárias seccionadas. Aqui, descrevemos como dissecar corações embrionárias de rato e Visualizar diretamente a formação de câmara ventricular de MLC-2v-tdTomato ratos usando microscopia epifluorescente todo de montagem. Com este método, é possível examinar diretamente a formação do tubo cardíaco e loop, em formação de câmara quatro sem mais experimental manipulação de embriões do rato. Embora a linha de bater-no rato repórter MLC-2v-tdTomato é usada no presente protocolo como um exemplo, este protocolo pode ser aplicado a outras linhas de rato transgénico repórter fluorescentes específicos do coração.
Introduction
Formação de câmara durante o desenvolvimento do coração é um complexo processo de transição através de vários estágios embrionários morfologicamente distintas1,2. A forma crescente de progenitoras cardíacas de população forma um tubo linear de coração e então sofre alongamento e looping para formar a forma espiral do coração em desenvolvimento. Após seu processo de septation, o coração em desenvolvimento é transformado em coração de quatro câmaras. Interrupção de qualquer um destes processos resulta em defeitos cardíacos do desenvolvimento. Assim, é importante compreender os mecanismos moleculares subjacentes a formação de câmara durante o desenvolvimento do coração. Apesar de numerosos estudos anteriores sobre o desenvolvimento do coração, nossa compreensão deste processo complexo continua a ser limitada.
Hibridação in situ, imuno-histoquímica e beta-galactosidase coloração usando ratos de repórter LacZ têm sido amplamente utilizados para estudar a formação de câmara durante o desenvolvimento de coração de rato por rotulagem cardíaco específico ou câmara genes estruturais específicos ou proteínas (por exemplo, Nppa, golpe-WR221, Irx4, MLC-2a e MLC-2v)3,4,5,6,7,8,9,10. No entanto, estas experiências com embriões de rato exigem um tempo significativo e perícia, porque várias etapas experimentais diferentes tem que ser executadas sequencialmente11. Aqui, descrevemos um método de microscopia epifluorescente de montagem toda simples para visualizar os ventrículos em desenvolvimento usando embriões dissecados de MLC-2v-tdTomato repórter bater-em ratos12. A vantagem deste método em comparação com métodos anteriormente utilizados é evitar etapas experimentais complexas que muitas vezes podem criar variações experimentais. O principal objectivo do presente protocolo é descrever como dissecar embriões do rato e corações em desenvolvimento e para examinar cada estágio do desenvolvimento de câmara cardíaca do mouse sem experimentos histochemical tediosos. Esse método pode ser facilmente aplicado para avaliar o desenvolvimento do coração usando várias outras linhas de rato transgénico rotulagem primeiros marcadores cardíacos (por exemplo, Mesp1Cre: Rosa26EYFP13, Isl1Cre: Rosa26EYFP13, Hcn4H2BGFP14, Hcn4Cre: Rosa mT / mg14, Nkx2-5Cre: Rosa mT/mG14, Hcn4-eGFP15, Isl1Cre: Rosa mT/mG14, Nkx2.5Cre: Rosa26tdTomato15e TgMef2c-AHF-GFP16 ratos).
Protocol
Representative Results
Discussion
O método descrito aqui é relativamente simples para examinar o desenvolvimento da câmara ventricular, sem realizar experimentos trabalhosos para rotular ventriculares ou cardíaco-específico genes estruturais ou proteínas. Assim, este método minimiza variabilities técnicas que eram frequentemente encontrados nas seções de coração immunostained.
Há duas etapas críticas para executar com êxito este método, incluindo a estimativa precisa da idade embrionária de camundongos e disse…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo NIH R03 HL140264 (Y.-J. N) e Gilead Sciences Research Scholar programa (Y.-J. N).
Materials
| dissecting microscope | Leica | MZ125 | |
| DNA ladder (100 bp) | Promega | G2101 | |
| epifluorescence dissecting microscope | Leica | M165 FC | |
| GoTaq Green master Mix | Promega | M712 | |
| PCR machine (master cycler) | Eppendorf | 6336000023 |
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