הדמיה של סידן דינמיקה באוכלוסיות משנה של תאים הלבלב איון של העכבר

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור דימות וכימות הדינמיקה סידן באוכלוסיות תאים הטרוגנית, כגון תאים איון הלבלב. כתבים פלורסנט מועברים לתוך שכבת היקפי של תאים בתוך איון, אשר לאחר מכן מאויית והתמונה, ועל ניתוח לתאים של הדינמיקה של עוצמת הניאון מבוצעת.

Abstract

הורמונים איון הלבלב להסדיר הומאוסטזיס דם הגלוקוז. שינויים בגלוקוז בדם לגרום לתנודות של סידן ציטומטוג בתאי איון הלבלב להפעיל הפרשה של שלושה הורמונים עיקריים: אינסולין (מ β-תאים), גלוקגון (α-תאים) ו סומטוסטטין (δ-תאים). β-תאים, אשר מהווים את רוב התאים של איון הם מצמידים חשמלית זה לזה, להגיב גירוי הגלוקוז כישות אחת בודדת. היכולת המδ של אוכלוסיות תת-משניות, α-תאים ותאי-תאים (ביצוע של כ -20% (30%) ו-4% (10%) של מכרסם הכולל¹ (אדם²) מספרים תא איון, בהתאמה) הוא פחות צפוי ולכן הוא בעל עניין מיוחד.

חיישנים סידן מועברים לתוך שכבת היקפי של תאים בתוך איון מבודד. איון או קבוצה של איונים הוא לאחר מכן מקיבוע והתמונה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטית. בחירת מצב ההדמיה היא בין תפוקה גבוהה יותר (שדה רחב) ורזולוציה מרחבית טובה יותר (confocal). כרגיל, סריקת לייזר מיקרוסקופ קונפוקלית משמש לרקמת דימות, כפי שהוא מספק את ההפרדה הטובה ביותר של האות בין התאים הסמוכים. ניתן גם לעשות שימוש במערכת רחב-שדות, אם האות המזהם מהאוכלוסייה הדומיננטית של β-תאים ממוזער.

לאחר הדינמיקה סידן בתגובה גירויים ספציפיים נרשמו, הנתונים מבוטאים בצורה מספרית כמו עוצמת הקרינה לעומת זמן, מנורמל על הזריחה הראשונית מתוקן בסיסית, כדי להסיר את ההשפעות המקושרות הלבנת של . בסדר, שיהיה שינויים בתדר הדקר או באזור חלקי מתחת לעקומה (pAUC) מחושבים לעומת זמן, כדי לכמת את האפקטים הנצפים. pAUC הוא רגיש יותר וחזק למדי ואילו תדירות העלייה מספק מידע נוסף על המנגנון להגדיל את הסידן.

אוכלוסיות משניות של תאים משניים ניתן לזהות באמצעות תגובות פונקציונלי כדי לסמן תרכובות, כגון אדרנלין ghrelin, לגרום שינויים סידן ציטוסולג באוכלוסיות מסוימות של תאים איון.

Introduction

מטרת השיטה היא תמונה בזמן אמת שינויים בריכוז סידן ציטוסולג ([Ca^{2 +}]_cyt) באוכלוסיות משנה משניות של תאים איון הלבלב. זה מאפשר לחשוף את המנגנונים המסדירים הפרשת הורמונים בתאים אלה, חשיפת פרטים על הצלב בין סוגי תאים שונים, פוטנציאל, החדרת ממד poptional לתוך התמונה הגדולה של איתות איון.

איונים מורכבים ממספר סוגי תאים. מלבד ידוע יותר הפרשה אינסולין β-תאים, יש לפחות שתי אוכלוסיות משנה כי הם גם קריטיים בוויסות הגלוקוז בדם³. α-תאים (העושים סביב 17% של תאים איון) להפריש גלוקגון כאשר הגלוקוז בדם מקבל נמוך מדי, אשר אותות עבור שחרור של גלוקוז לתוך הדם מהמחסנים בכבד. רמות גלוקגון מוגזמת (היפרגלולומיה) וליקויי שליטה של גלוקגון-שחרור מלווים (ומבחינה טכנית, יכול לתרום) מצב טרום סוכרת של רגישות לקויה לאינסולין⁴. δ-תאים (סביב 2%) להפריש סוסטטין בתגובה העלאת גלוקוז. זה הורמון פפטיד בכל מקום צפוי להיות נוכח ריכוזים גבוהים בקרבת α-ו-β-תאים בתוך איונים, אשר יש חזק G_אני קולטן מתווך השפעה על גלוקגון והפרשת אינסולין.

α-תאים ו-δ-תאים לשתף חלק גדול של מכונות חישת גלוקוז עם קרובי משפחה קרובים שלהם השושלת, β-תאים. כל שלושת התאים מצוידים ב-ATP תלויי K⁺ ערוצים, חיישנים מטבוליים מורכבים⁵ השולטים הפוטנציאל קרום הפלזמה של תאים אלה להתרגש. במקביל, הפרשת אינסולין, סומטוסטטין וגלוקגון מוסדר באופן שונה על ידי גלוקוז. הדמיה של Ca^{2 +} דינמיקה בשני אוכלוסיות משנה קטין של תאים איון יכול אפוא לספק תובנה על הצלב בין הגלוקוז בדם ופלט הפרשה איון.

נסיונות מוקדמים של ניטור היכולת הδ של α-ו-תאים באמצעות תיקון-מלחציים אלקטרופיזיולוגיה ואחריו בקרוב הדמיה של Ca^{2 +} ב יחיד α-ו-δ-תאים. הזהות של תאים בניסויים אלה אומתה באמצעות כתמים פוגיורי עם נוגדנים אנטי גלוקגון או אנטי סומטוסטטין. מאמצים אלה היו לעתים קרובות הקשו על ידי מציאת תאים איון להתנהג בצורה שונה מאוד בתוך איון וכתאים בודדים. למרות β-תאים עשוי להיראות התורמים העיקריים של ההסדר איון (בשל הרוב המכריע שלהם שבתוכו צימוד חשמלי חזק שלהם), הפער העיקרי היה, למרבה ההפתעה, נמצא α-תאים. בתוך איון שלם, תאים אלה הם כל הזמן ובהתמדה מופעל על גלוקוז נמוך, אשר נכון רק עבור כ 7% של מפוזרים אחד α-תאים⁶. דיווח על פעילות של α-ו-δ-תאים בתוך איונים שלמים הוא ולכן האמין לייצג הערכה קרובה יותר של בתנאים vivo.

באופן כללי, ישנן שתי דרכים לדווח על Ca^{2 +} דינמיקה במיוחד מתוך α-תא או δ-תאים משנה: (i) המבטא Ca מקודד גנטית^{2 +} חיישן באמצעות מקדם רקמות ספציפי או (ii) באמצעות מרכיבי סמן. הגישה לשעבר אלגנטי יותר מוסיף את היתרון הניכר של הדמיה האמיתי 3D ולכן לימוד של התפלגות התא בתוך איון. זה לא יכול להיות מיושם עם כל חומר איון האנושי שלם. הדאגה הפוטנציאלית נוספת היא ‘ לדאוג ‘ של היזם, במיוחד כאשר β-/α-תא בידול או α-תא התגובה לגלוקוז גבוה נמצא במקום. ניתן להשתמש בגישה האחרונה עם רקמה מבודדת טרייה, כולל דגימות אנושיות או איונים מתורבתים. הנתונים, עם זאת, נאסף אך ורק מן השכבה ההיקפית של תאים איון, כמו אספקת מולקולה לצבוע/סמן בשכבות עמוקות יותר מבלי לשנות את האדריכלות איון הוא מאתגר. יתרון בלתי צפוי של הגישה האחרונה הוא התאימות עם מצב דימות שטח רחב, אשר מאפשר לטפס את הניסויים להדמיה סימולטני של עשרות או מאות איונים (כלומר, אלפי עד עשרות אלפי תאים).

סידן הוא התמונה ב vivo באמצעות מקודד גנטית gcamp⁷ (או קרום הלב⁸) משפחה חיישנים, אשר הם משתנים של חלבון פלורסנט מוטציה ירוקה (gcamp) התמזגו הסידן מחייב חלבון קלמודולין ואת רצף היעד שלה, M13 קטע של רירן שרשרת האור קינאז^7,9. Gcamps יש יחסי אות לרעש מעולה בטווח של nanomolar Ca^{2 +} ריכוזי ו-2-פוטון גבוהה-חתך, מה שהופך אותם בחירה אידיאלית עבור vivo עבודה^10,11. ההיבט המאתגר של שימוש בחיישנים רקומביננטי הוא המסירה שלהם לתוך התאים. הביטוי הטרוולוגי דורש שימוש בווקטור וקטור ויראלי רב שעות לשעבר vivo culturing, אשר לעתים קרובות מעלה חששות לגבי בידול פוטנציאלי או הידרדרות של פונקציות התא. למרות מודלים העכבר מראש מהונדסים לבטא GCaMP בעיה זו, הם מוסיפים אתגרים חדשים על ידי הגדלת זמן החפיפה באופן משמעותי והגבלת העבודה למודל לא אנושי. רגישות גבוהה מאוד שינויים של pH תאיים הוא עוד צד שלילית של חיישנים מבוססי חלבון¹², אשר, עם זאת, פחות בעיה לחישה אותות מנדנוד, כגון Ca^{2 +}.

היתרון של צבעים הניתנים למיפוי (כגון פלורסנט ירוק Fluo4) הוא שהם יכולים להיות נטענים לתוך רקמה מבודדת טרי בתוך כשעה. באופן כצפוי, צבעים הניתנת למיפוי כוללים יחס נמוך יותר של אות לרעש ו-(הרבה) פוטויציבות נמוכה יותר מאשר עמיתיהם הרקומביננטי. אנחנו לא יכולים לאשר¹³ דוחות של רעילות של צבעים הניתנים למיפוי¹⁴, עם זאת, העמסת צבע היא בעיה תכופה.

Red רקומביננטי Ca^{2 +} חיישנים המבוססים על תמורה מעגלית התפתחו במהירות מאז 2011¹⁵, וההתפתחויות האחרונות להציג תחרות חזקה gcamps¹⁶ לדימות רקמות, נתון עומק גבוה יותר של חדירה של אור אדום. צבעים מסחרית זמין אדום למיפוי ניתן להשתמש מהימן עבור הדמיה בודדת תא, אבל, ברמת הרקמה, לא יכול להתחרות היטב עם אנלוגיות ירוק.

יש לכאורה מעט מאוד בחירה של טכנולוגיית הדמיה לניסויים ברקמה שבה אור מחוץ לפוקוס הופך לבעיה קריטית. המערכת קונפוקלית מספק רזולוציה מקובלת תא יחיד על ידי ביטול של אור out-of-פוקוס עם כל מטרה על NA לעיל 0.3 (עבור המקרה של GCaMP6) או 0.8 (צבע למיפוי). במובן הטכני, מיקרוסקופ קונפוקלית וקד קונבנציונאלי ניתן להשתמש עבור הדמיה בו של [Ca^{2 +}]_cyt ממאות (gcamp) או עשרות איונים (צבע למיפוי). החלופה הריאלית היחידה למצב קונפוקלית וקד במקרה של ביטוי תלת-ממד של החיישן ברקמה היא אולי מיקרוסקופ גיליון קל.

הדברים הם מעט שונה עבור המקרה כאשר החיישן מתבטא בשכבת היקפית של תאים בתוך רקמת איון. עבור חיישנים רקומביננטי בהירים כי יש דפוס ביטוי תאיים בצורה מלאת חיים, באמצעות מצב הדמיה שטח רחב עם מטרה נמוכה-NA עשוי לספק איכות מספקת תגמול החוקר עם עלייה משמעותית בשדה של שטח התצוגה ומכאן ה תפוקה. מערכת רחבה מספקת את הרזולוציה המרחבית העניים יותר, כאשר האור היוצא מהמוקד אינו מבוטל; לכן, רקמת הדמיה עם high-NA (עומק נמוך של שדה) מטרות אינפורמטיבי פחות, כמו האות תא בודד הוא מזוהם בהרבה על ידי תאים שכנים. הזיהום הוא הרבה יותר קטן עבור נמוך-NA (עומק גבוה של השדה) יעדים.

עם זאת, קיימות משימות שעבורן תפוקה גבוהה ו/או קצב דגימה יהפכו ליתרון קריטי. α-ו-δ-תאים התערוכה טרוגניות משמעותי, אשר יוצר ביקוש לגדלים גבוהים לדגום כדי לחשוף את התרומה של אוכלוסיות תת. הדמיה שטח רחב הוא מהיר ורגיש יותר, עם הדמיה של שדה גדול בקנה מידה של מערכת תצוגה מאות (gcamp) או עשרות (Fluo4) של איונים באותו יחס אות לרעש כמו ניסויים קונפוקלית וקד על 10 או איון אחד, בהתאמה. הבדל זה בתפוקה הופך את יתרון המערכת לשטח רחב עבור הדמיה בעלת רזולוציה של תא בודד, שיכולה להיות קריטית במיוחד עבור אוכלוסיות משנה קטנות כגון δ-cell 1. באופן דומה, ניסיונות לשחזר את פעילות החשמל מ-Ca^{2 +} הטבה¹⁷ יהנה מקצב הדגימה הגבוה יותר שסופק על-ידי מצב הדמיה של שדה רחב. באותו זמן, כמה “נישה” בעיות כמו הפעילות של הלבלב α-תאים על גירוי של β-cell שולט האוכלוסייה המשנה, לדרוש שימוש במערכת קונפוקלית וקד. גורם המשפיע על ההחלטה לקראת מצב של מוקד הוא נוכחות של אות מזהם ניכר מאוכלוסיית המשנה β cell.

למרות שימוש בנוגדן ספציפי הורמון מכתים כדי לאמת את זהותו של התאים לאחר ניסויים הדמיה היא עדיין אופציה, תת האוכלוסיות התא מינורי ניתן לזהות באמצעות תרכובות סמן פונקציונלי, כגון אדרנלין גרלין שהיו הראו סלקטיבי לעורר Ca^{2 +} דינמיקה ב α-¹⁸ ו-δ-תאים^19,20, בהתאמה.

הניתוח של נתוני הדמיה בזמן שואפת לספק מידע מעבר לפרמקולוגיה טריוויאלית, כגון טרוגניות, מתאם ואינטראקציה של אותות שונים. מקובל, נתוני הדמיה מנותח כעוצמה לעומת הזמן מנורמל הזריחה הראשונית (F/F₀). תיקון בסיסי נדרש לעתים קרובות, בשל הלבנת האות fluorophore או זיהום על ידי שינויים באור פלואורסצנטית או pH (בדרך כלל נגרמת על ידי רמות millimolar של גלוקוז¹²). Ca^{2 +} נתונים ניתן לנתח בדרכים שונות רבות, אבל שלוש מגמות עיקריות הן למדוד שינויים בתדר ספייק, שבר הרמה, או באזור תחת העקומה, מחושב לעומת זמן. מצאנו את יתרון הגישה האחרון, במיוחד ביישום מידע ממוקד ביותר שנדגמו. היתרון של מדד pAUC הוא הרגישות שלה לשני השינויים בתדר ובשרעת האותות, בעוד שחישוב התדר מחייב מספר משמעותי של תנודות במספר²¹, שקשה להשיג באמצעות הדמיה קונבנציונאלית. הגורם המגביל של ניתוח pAUC הוא הרגישות הגבוהה שלה לשינויים בסיסיים.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן פותחו בהתאם לחוק בעלי חיים בבריטניה (הליכים מדעיים) (1986) וההנחיות האתיות של אוניברסיטת אוקספורד. 1. לבודד לבלב איים הלבלב הכן את מדיום התרבות ואת פתרון הבידוד. הפוך את מדיום התרבות: RMPI1640 (ראה טבלת חומרים), שיושלם עם 10% סרום עגל עוברי, 100 ?…

Representative Results

האיים לטעון היטב עם הצבעים הניתנת למיפוי (איור 1א), אלא אם הרכב השומנים של הקרום הושפע (למשל, על ידי חשיפה כרונית לחומצות שומן). האדם אדנווירוס סוג 5 (Ad5) וקטור גם מטרות כל התאים איון (איור 1B). בעיות עלולות להתעורר כאשר יותר מחיישן רקומביננטי אח…

Discussion

ישנם שלושה שלבים בפרוטוקול הקריטיים להצלחה הכללית. הזרקה מוצלחת של האנזים Liberase לתוך צינור המרה קובע לא רק את ההצלחה הכמותית של הליך הבידוד, אלא גם משפיע על האיכות של איונים מבודדים. Pancreata מנופח עלול לגרום להעדר כמה תגובות מטבולית חשוב באיים מבודדים. שנית, טעינת הצבע/ביטוי החיישן מגדירה את ה…

Materials

40x/1.3 objective
Axiovert 200 microscope
emission
Excitation
Fetal bovine serum	Sigma-Аldrich	F7524-500ML
Fluo4	ThermoFisher (Life Technologies)	F14201
GCaMP6f, in (human type 5) adenoviral vector	Vector Biolabs	1910
Hanks' solution	ThermoFisher (GibCo, Life Technologies)
Liberase	Sigma-Аldrich	5401020001
penicillin/streptomycin	ThermoFisher (GibCo, Life Technologies)	15140122
RPMI medium	ThermoFisher (GibCo, Life Technologies)	61870044
Zeiss LSM510-META confocal system	Carl Zeiss