마우스 췌도 세포의 하위 집단에 있는 화상 진찰 칼슘 역학
Summary
여기에서, 우리는 췌도 세포와 같은 이기종 세포 집단에 있는 칼슘 역학을 화상 진찰 그리고 정량화하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 형광 기자는 그 때 고정화되고 심상되는, 그리고 형광 강렬의 역학의 세포 당 분석이 수행되는 작은 틀 내의 세포의 말초 층으로 전달됩니다.
Abstract
췌도 호르몬은 혈당 항상성을 조절합니다. 혈당의 변화는 세 가지 주요 호르몬의 분비를 유발하는 췌도 세포에서 세포칼슘의 진동을 유도합니다: 인슐린 (β 세포에서), 글루카곤 (α 세포) 및 소마토스타틴 (δ 세포). β 세포는 대부분의 아일렛 세포를 구성하고 전기적으로 서로 결합되어 하나의 단일 개체로서 포도당 자극에 반응합니다. 사소한 소집단, α 세포 및 δ 세포의 흥분성 (약 20 % (30 %)을 구성 4% (10%) 총 설치류1 (인간2)아일렛 세포 번호각각 예측하기 어렵고 따라서 특별한 관심사입니다.
칼슘 센서는 분리된 아일렛 내의 세포의 주변 층으로 전달됩니다. 섬 또는 작은 섬의 그룹은 그 때 형광 현미경을 사용하여 고정되고 화상화됩니다. 이미징 모드의 선택은 더 높은 처리량(광시야)과 더 나은 공간 해상도(공초점) 사이에서 선택됩니다. 종래, 레이저 스캐닝 공초점 현미경은 이미징 조직에 사용되며, 이는 인접한 세포 들 사이의 신호를 가장 잘 분리하는 것을 제공하기 때문에. β 세포의 지배적인 집단으로부터의 오염 신호가 최소화되는 경우, 광시야 시스템도 활용할 수 있다.
특정 자극에 반응하는 칼슘 역학이 기록되면, 데이터는 형광 강도 대 시간으로 수치 형태로 표현되고, 초기 형광및 기준선 보정으로 정규화되어, 표백에 연결된 효과를 제거하기 위해, 형광소. 곡선(pAUC) 아래의 스파이크 주파수 또는 부분 영역의 변화는 관찰된 효과를 정량화하기 위해 시간 대비 계산됩니다. pAUC는 더 민감하고 매우 강력한 반면 급증 주파수는 칼슘 증가의 메커니즘에 대한 자세한 정보를 제공합니다.
작은 세포 소집단은 아일렛 세포의 특정 집단에서 세포질 칼슘의 변화를 유도하는 아드레날린과 그렐린과 같은 마커 화합물에 대한 기능적 반응을 사용하여 식별될 수 있습니다.
Introduction
이 방법의 목적은 췌도 세포의 작은 소집단에서 세포질 칼슘 농도 ([Ca2+]cyt)의실시간 변화를 이미지화하는 것입니다. 이것은 이 세포에 있는 호르몬 분비를 지배하는 기계장치를 폭로하는 것을 허용합니다, 다른 세포 모형 사이 상호 이야기에 관하여 세부사항을 드러내고, 잠재적으로, 작은 쪽지 신호의 더 큰 그림으로 인구 차원을 소개합니다.
작은 섬은 여러 세포 유형으로 구성되어 있습니다. 더 잘 알려진 인슐린 분비 β 세포 외에, 혈액 포도당 조절에 또한 중요한 적어도 2개의 소집단이있습니다 3. α-세포 (그 주위 구성 17% 작은 연세포의) 혈액 포도 당이 너무 낮아질 때 글루카곤을 분비, 이는 간에서 창고에서 혈류로 포도당의 방출을위한 신호. 과도 한 글루카곤 수준 (hyperglucagonemia) 및 글루카곤 방출의 장애인 제어 동반 (그리고, 기술적으로, 에 기여할 수 있습니다) 장애인인슐린 감수성의 당뇨병 상태4. δ-세포 (약 2%) 포도당 상승에 반응하여 소마토스타틴을 분비합니다. 이러한 유비쿼터스 펩티드 호르몬은 아일렛 내α 세포 및 β 세포 부근에서 고농도로 존재할 가능성이 높으며, 이는 글루카곤 및 인슐린 분비 모두에 강한 Gi 수용체 매개 감쇠 효과를 갖는다.
α-세포 및 δ 세포는 그들의 가까운 혈통 친척, β 세포와 포도당 감지 기계의 큰 부분을 공유합니다. 모든 3개의 세포 모형은 ATP 에 민감한 K+ 채널을, 이 흥분성 세포의 혈장 막 전위를 통제하는 정교한 신진 대사 센서5를 갖추고 있습니다. 동시에, 인슐린의 분 비, 소마토 스타 틴과 글루카곤포도당에 의해 다르게 조절됩니다. 따라서 작은 소집단인 작은 소집단에서 Ca2+ 역학의 이미징은 따라서 혈당과 아일레 분비 출력 사이의 교차 토크에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.
패치 클램프 전기 생리학을 사용하여 α- 및 δ 세포의 흥분성을 모니터링하는 초기 시도는 곧 단일 α- 및 δ 세포에서Ca2+의 이미징이 뒤따랐다. 이러한 실험에서 세포의 동일성항글루카곤 또는 항소마토스타틴 항체로 염색된 후세를 통해 세포의 동일을 검증하였다. 이러한 노력은 종종 아일렛 세포가 아일렛 내에서 단일 세포로서 매우 다르게 행동한다는 발견에 의해 방해되었습니다. β 세포가 작은 살레기 배열의 주요 후원자인 것처럼 보일 수 있지만 (그들의 강한 전기 결합의 기초가 되는 그들의 압도적인 대다수 때문에), 주요 불일치는, 놀랍게도, α 세포에서 찾아냈습니다. 본래 본래 의 본체 내에서, 이 세포는 단 하나 분산된 α 세포의 약 7%에 대해서만 사실인 낮은 포도당에서 지속적으로 지속적으로 활성화됩니다6. 따라서 본래 섬 내에서 α- 및 δ-세포의 활성을 보고하는 것은 생체 내 상태의 근사치를 나타내는 것으로 여겨진다.
일반적으로 α 세포 또는 δ 세포 하위 집단으로부터Ca2+ 역학을 보고하는 두 가지 방법이 있습니다: (i) 조직 특이적 프로모터를 통해 유전자 로 코딩된Ca2+ 센서를 발현하거나 (ii) 마커 화합물을 사용하여. 더 우아한 전자 접근은 실제 3D 화상 진찰의 실질적인 이점을 추가하고 따라서 작은 쪽안에 세포 분포의 공부합니다. 그러나 그대로 인간 본도 재료에 적용 할 수 없습니다. 또 다른 잠재적관심사는 프로모터의 ‘누설’이며, 특히 β-/α 세포 분화 또는 높은 포도당에 대한 α 세포 반응이 제자리에 있을 때이다. 후자의 접근법은 인간 샘플 또는 배양된 섬을 포함하는 신선하게 단리된 조직과 함께 사용될 수 있다. 그러나 이 데이터는 아일렛 구조를 변경하지 않고 더 깊은 층으로 염료/마커 분자를 전달하는 것이 쉽지 않은 것처럼, 아일렛 세포의 주변 층에서만 수집됩니다. 후자의 접근 법의 예기치 않은 장점은 광시야 이미징 모드와의 호환성으로, 실험을 확장하여 수십 또는 수백 개의 섬(즉, 수천에서 수만 개의 셀)을 동시에 이미징할 수 있다는 것입니다.
칼슘은 유전자 부호인 GCaMP7(또는 페리캠8)패밀리 센서를 사용하여 생체 내에서 이미지화되며, 이는 칼슘 결합 단백질 칼모둘린과 그 표적 서열에 융합된 원형 변광녹색 형광 단백질(GFP)의 변이체인 미오신 경전사슬 키나아제 의 M13 단편7,9. GCaMP는 나노 몰 Ca2 + 농도및 높은 2 광자 단면 범위에서 뛰어난 신호 대 잡음 비율을 가지고 있어 생체 내 작업10,11에이상적인 선택입니다. 재조합 센서를 사용하는 도전적인 측면은 세포로의 전달입니다. 이종발현은 바이러스 벡터 및 다시간 생체배구를 사용하여 세포 기능의 잠재적 탈분화 또는 악화에 관한 우려를 자주 제기한다. GCaMP를 표현하기 위해 미리 설계된 마우스 모델은 이 문제를 해결하지만 리드 타임을 크게 늘리고 작업을 비인간 모델로 제한하여 새로운 과제를 추가합니다. 세포내 pH의 변화에 대한 매우 높은 민감도는 단백질 기반센서(12)의또 다른 불리한 측면이며, 이는Ca2+와같은 진동 신호를 감지하는 데 문제가 적다.
트랩형 염료(예: 녹색 형광 Fluo4)의 장점은 약 1시간 이내에 새로 단리된 조직으로 적재할 수 있다는 것입니다. 예측할 수 있듯이, 트랩형 염료는 신호 대 잡음 비가 낮고 재조합 에 비해 광안정성이 훨씬 낮습니다. 13의 염료의 독성보고는 확인할 수없지만,염료 과부하가 빈번한 문제점이 있다.
원형 순열에 기초한 적색 재조합 Ca2+ 센서는 2011년15년이후 급속히 진화해 왔으며, 가장 최근의 발전은 적색광의 침투 깊이가 높은 조직 이미징을 위한 GCaMP16에 대한 강력한 경쟁을 제시합니다. 시판되는 적색 트랩포블 염료는 단세포 이미징에 안정적으로 사용될 수 있지만 조직 수준에서는 녹색 유사체와 잘 경쟁할 수 없습니다.
초점이 다른 빛이 중요한 문제가되는 조직에서 실험을위한 이미징 기술의 선택은 거의 없습니다. 공초점 시스템은 0.3(GCaMP6의 경우) 또는 0.8(트랩 가능한 염료)의 경우 NA에서 임의의 목표와 함께 초점이 벗어난 빛을 취소하여 허용 가능한 단일 셀 분해능을 제공한다. 기술적 의미에서, 기존의 공초점 현미경은 수백 (GCaMP) 또는 수십 개의 섬 (트랩 가능한 염료)에서[Ca2+]방사체의 동시 이미징에 사용될 수 있습니다. 조직에서 센서를 3D 로 표현하는 경우 공초점 모드에 대한 유일한 현실적인 대안은 아마도 가벼운 시트 현미경 검사법일 것입니다.
센서가 아일렛 조직 내의 세포의 주변 층에서 발현되는 경우 상황은 약간 다릅니다. 생생한 세포내 발현 패턴을 가진 밝은 재조합 센서의 경우, 낮은 NA 목표를 가진 광시야 이미징 모드를 사용하면 충분한 품질을 제공하고 시야영역이 크게 증가하여 연구자가 보상을 할 수 있습니다. 처리량. 광시야 시스템은 초점이 벗어난 조명이 취소되지 않기 때문에 더 낮은 공간 해상도를 제공합니다. 따라서, 높은 NA (낮은 피사계 심도) 목표를 가진 화상 진찰 조직은 단세포 신호가 이웃 세포에 의해 엄청나게 오염하기 때문에, 보다 적게 유익합니다. 저NA(높은 피사계 심도) 목표에 대해서는 오염이 훨씬 작습니다.
그러나 높은 처리량 및/또는 샘플링 속도가 중요한 이점이 되는 작업이 있습니다. α- 및 δ 세포는 상당한 이질성을 나타내며, 이는 하위 집단의 기여도를 밝히기 위해 높은 샘플 크기에 대한 수요를 생성합니다. 광시야 이미징은 10개 또는 단일 섬에 대한 공초점 실험과 동일한 신호 대 잡음 비로 수백(GCaMP) 또는 수십(Fluo4) 규모의 대규모 시야 시스템 이미징을 통해 빠르고 민감합니다. 처리량의 이러한 차이는 단일 셀 해상도를 가진 인구 이미징에 대한 광시야 시스템을 유리하게 만들며, 이는 δ 셀 과 같은 작은 하위 집단에 특히 중요할 수 있습니다. 마찬가지로 Ca2+ 스파이크17에서 전기 활동을 재구성하려는 시도는 광시야 이미징 모드에서 제공하는 더 높은 샘플링 속도의 이점을 누릴 수 있습니다. 동시에, 지배적인 β 세포 소집단의 자극시 췌장 α 세포의 활성과 같은 몇몇 “틈새” 문제는 공초점 시스템의 사용을 필요로 한다. 공초점 모드로의 결정에 영향을 미치는 요인은 β 세포 하위 집단으로부터 실질적인 오염 신호의 존재이다.
이미징 실험 후 세포의 정체성을 확인하기 위해 호르몬 특이적 항체 염색을 사용하더라도, 작은 세포 소집단은 α-18 및 δ-세포19,20에서Ca2+ 역학을 선택적으로 자극하는 것으로 나타난 아드레날린 및 그렐린과 같은 기능적 마커 화합물을 사용하여 식별될 수 있다.
타임랩스 이미징 데이터의 분석은 인구 이질성, 상관 관계 및 다른 신호의 상호 작용과 같은 사소한 약리학 을 넘어서는 정보를 제공하는 것을 목표로합니다. 종래, 이미징 데이터는 강도 대 시간으로 분석되고 초기 형광(F/F0)으로정규화된다. 기저선 보정은 자가형광 또는 pH의 변화에 의한 형광포 신호의 표백 또는 오염으로 인해 빈번하게 필요하다(전형적으로 포도당12의밀리몰 수준에 의해 유도된다). Ca2+ 데이터는 여러 가지 방법으로 분석할 수 있지만, 세 가지 주요 추세는 스파이크 주파수, 고원 분획 또는 곡선 아래의 영역의 변화를 측정하여 계산된 시간대 계산하는 것입니다. 특히 샘플링이 부족한 공초점 데이터에 대한 응용 분야에서 후자의 접근 방식이 유리하다는 것을 발견했습니다. pAUC 메트릭의 장점은 신호 주파수와 진폭의 변화에 대한 민감도이며, 주파수를 계산하려면 상당한 수의진동(21)이필요하며, 이는 기존의 이미징을 사용하여 달성하기 어렵다는 것입니다. pAUC 분석의 제한 요인은 기준선 변화에 대한 높은 민감도입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
프로토콜에는 전반적인 성공에 중요한 세 단계가 있습니다. 담관에 Liberase 효소를 성공적으로 주입하면 격리 절차의 양적 성공뿐만 아니라 고립 된 섬의 품질에도 영향을 미칩니다. 팽창되지 않은 췌장은 고립 된 섬에 있는 몇몇 중요한 신진 대사 반응의 부족 귀착될 수 있습니다. 둘째, 센서의 염료/표현의 로딩은 타임랩스 기록의 신호 대 잡음 비율을 정의합니다. 과부하된 섬에 신호가 없거나 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AH는 당뇨병 영국 박사 과정 학생의 수혜자, EV는 OXION-웰컴 신뢰 교육 프로그램에 의해 지원되었다, AIT는 옥스포드 생물 의학 연구 위원회 박사 후 펠로우십을 개최.
Materials
| 40x/1.3 objective | |||
| Axiovert 200 microscope | |||
| emission | |||
| Excitation | |||
| Fetal bovine serum | Sigma-Аldrich | F7524-500ML | |
| Fluo4 | ThermoFisher (Life Technologies) | F14201 | |
| GCaMP6f, in (human type 5) adenoviral vector | Vector Biolabs | 1910 | |
| Hanks' solution | ThermoFisher (GibCo, Life Technologies) | ||
| Liberase | Sigma-Аldrich | 5401020001 | |
| penicillin/streptomycin | ThermoFisher (GibCo, Life Technologies) | 15140122 | |
| RPMI medium | ThermoFisher (GibCo, Life Technologies) | 61870044 | |
| Zeiss LSM510-META confocal system | Carl Zeiss |
References
- Elayat, A. A., el-Naggar, M. M., Tahir, M. An immunocytochemical and morphometric study of the rat pancreatic islets. Journal of Anatomy. 186, 629 (1995).
- Cabrera, O., et al. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (7), 2334-2339 (2006).
- Brereton, M. F., Vergari, E., Zhang, Q., Clark, A. Alpha-, delta-and PP-cells: are they the architectural cornerstones of islet structure and co-ordination. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 63 (8), 575-591 (2015).
- Færch, K., et al. Insulin resistance is accompanied by increased fasting glucagon and delayed glucagon suppression in individuals with normal and impaired glucose regulation. Diabetes. 65 (11), 3473-3481 (2016).
- Dabrowski, M., Tarasov, A., Ashcroft, F. M. Mapping the architecture of the ATP-binding site of the KATP channel subunit Kir6 2. The Journal of Physiology. 557 (2), 347-354 (2004).
- Liu, Y. J., Vieira, E., Gylfe, E. A store-operated mechanism determines the activity of the electrically excitable glucagon-secreting pancreatic alpha-cell. Cell Calcium. 35 (4), 357-365 (2004).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca 2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137 (2001).
- Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (6), 3197-3202 (2001).
- Broussard, G. J., Liang, R., Tian, L. Monitoring activity in neural circuits with genetically encoded indicators. Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 97 (2014).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Rodriguez, E. A., et al. The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42 (2), 111-129 (2017).
- Tarasov, A. I., Rutter, G. A. . Methods in enzymology. 542, 289-311 (2014).
- Tarasov, A. I., et al. Frequency-dependent mitochondrial Ca(2+) accumulation regulates ATP synthesis in pancreatic β cells. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 465 (4), 543-554 (2013).
- Smith, N. A., et al. Fluorescent Ca2+ indicators directly inhibit the Na, K-ATPase and disrupt cellular functions. Science Signal. 11 (515), 2039 (2018).
- Zhao, Y., et al. An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators. Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).
- Dana, H., et al. Sensitive red protein calcium indicators for imaging neural activity. Elife. 5, 12727 (2016).
- Theis, L., et al. Benchmarking Spike Rate Inference in Population Calcium Imaging. Neuron. 90 (3), 471-482 (2016).
- Hamilton, A., et al. Adrenaline Stimulates Glucagon Secretion by Tpc2-Dependent Ca(2+) Mobilization From Acidic Stores in Pancreatic alpha-Cells. Diabetes. 67 (6), 1128-1139 (2018).
- Adriaenssens, A. E., et al. Transcriptomic profiling of pancreatic alpha, beta and delta cell populations identifies delta cells as a principal target for ghrelin in mouse islets. Diabetologia. 59 (10), 2156-2165 (2016).
- DiGruccio, M. R., et al. Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets. Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).
- Mourao, M., Satin, L., Schnell, S. Optimal experimental design to estimate statistically significant periods of oscillations in time course data. PloS One. 9 (4), 93826 (2014).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
- Cabrera, O., et al. Glutamate is a positive autocrine signal for glucagon release. Cell Metabolism. 7 (6), 545-554 (2008).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
- Tarasov, A. I., et al. Monitoring real-time hormone release kinetics via high-content 3-D imaging of compensatory endocytosis. Lab on a Chip. 18 (18), 2838-2848 (2018).
- Knudsen, J. G., et al. Dysregulation of Glucagon Secretion by Hyperglycemia-Induced Sodium-Dependent Reduction of ATP Production. Cell Metabolism. , (2018).
- Adam, J., et al. Fumarate hydratase deletion in pancreatic β cells leads to progressive diabetes. Cell Reports. 20 (13), 3135-3148 (2017).
- Wills, Q. F., et al. Statistical approaches and software for clustering islet cell functional heterogeneity. Islets. 8 (2), 48-56 (2016).
- Berggren, P. O., Ostenson, C. G., Petersson, B., Hellman, B. Evidence for divergent glucose effects on calcium metabolism in pancreatic beta- and alpha 2-cells. Endocrinology. 105 (6), 1463-1468 (1979).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
- Longo, E. A., et al. Oscillations in cytosolic free Ca2+, oxygen consumption, and insulin secretion in glucose-stimulated rat pancreatic islets. The Journal of Biological Chemistry. 266 (14), 9314-9319 (1991).
- Johansson, H., Gylfe, E., Hellman, B. Cyclic AMP raises cytoplasmic calcium in pancreatic alpha 2-cells by mobilizing calcium incorporated in response to glucose. Cell Calcium. 10 (4), 205-211 (1989).
- Grapengiesser, E., Gylfe, E., Hellman, B. Three types of cytoplasmic Ca2+ oscillations in stimulated pancreatic β-cells. Archives of Biochemistry and Biophysics. 268 (1), 404-407 (1989).
- Okamoto, Y., et al. Role of cytosolic Ca2+ in impaired sensitivity to glucose of rat pancreatic islets exposed to high glucose in vitro. Diabetes. 41 (12), 1555-1561 (1992).
- Gilon, P., Henquin, J. C. Influence of membrane potential changes on cytoplasmic Ca2+ concentration in an electrically excitable cell, the insulin-secreting pancreatic B-cell. The Journal of Biological Chemistry. 267 (29), 20713-20720 (1992).
- Valdeolmillos, M., Nadal, A., Soria, B., Garcia-Sancho, J. Fluorescence digital image analysis of glucose-induced [Ca2+]i oscillations in mouse pancreatic islets of Langerhans. Diabetes. 42 (8), 1210-1214 (1993).
- Cheng, H., Lederer, W. J., Cannell, M. B. Calcium sparks: elementary events underlying excitation-contraction coupling in heart muscle. Science. 262 (5134), 740-744 (1993).
- Stout, A. L., Axelrod, D. Evanescent field excitation of fluorescence by epi-illumination microscopy. Applied Optics. 28 (24), 5237-5242 (1989).
- Stozer, A., Dolensek, J., Rupnik, M. S. Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices. PloS One. 8 (1), 54638 (2013).
- Tian, G., Sandler, S., Gylfe, E., Tengholm, A. Glucose- and hormone-induced cAMP oscillations in alpha- and beta-cells within intact pancreatic islets. Diabetes. 60 (5), 1535-1543 (2011).
- Benninger, R. K., Zhang, M., Head, W. S., Satin, L. S., Piston, D. W. Gap junction coupling and calcium waves in the pancreatic islet. Biophysical Journal. 95 (11), 5048-5061 (2008).
- van Gurp, L., et al. Sequential intravital imaging reveals in vivo dynamics of pancreatic tissue transplanted under the kidney capsule in mice. Diabetologia. 59 (11), 2387-2392 (2016).
