Imagen de la dinámica del calcio en subpoblaciones de células de islotes pancreáticos de ratón

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para la toma de imágenes y la cuantificación de la dinámica de calcio en poblaciones de células heterogéneas, como las células de los islotes pancreáticos. Los reporteros fluorescentes se entregan en la capa periférica de las células dentro del islotes, que luego se inmoviliza e imagen, y se realiza un análisis por célula de la dinámica de la intensidad de la fluorescencia.

Abstract

Las hormonas de los islotes pancreáticos regulan la homeostasis de glucosa en sangre. Los cambios en la glucosa en la sangre inducen oscilaciones de calcio citosólico en las células de los islotes pancreáticos que desencadenan la secreción de tres hormonas principales: insulina (de las células de la sangre), glucagón (células) y somatostatina (células). Las células, que conforman la mayoría de las células de los isletes y están conectadas eléctricamente entre sí, responden al estímulo de la glucosa como una sola entidad. La excitabilidad de las subpoblaciones menores, las células y las células (que sube alrededor del 20% (30%) y 4% (10%) del total de números de celda de islote de roedores¹ (humano^2),respectivamente) es menos predecible y, por lo tanto, es de especial interés.

Los sensores de calcio se envían a la capa periférica de células dentro del islo aislado. El islotes o un grupo de islotes se inmoviliza e imagen mediante un microscopio de fluorescencia. La elección del modo de imagen es entre un mayor rendimiento (campo ancho) y una mejor resolución espacial (confocal). Convencionalmente, la microscopía confocal de escaneo láser se utiliza para la toma de imágenes del tejido, ya que proporciona la mejor separación de la señal entre las células vecinas. También se puede utilizar un sistema de campo ancho si se minimiza la señal contaminante de la población dominante de las células de la célula.

Una vez que se han registrado la dinámica de calcio en respuesta a estímulos específicos, los datos se expresan en forma numérica como intensidad de fluorescencia frente al tiempo, normalizada a la fluorescencia inicial y corregida en línea, para eliminar los efectos relacionados con el blanqueo del blanqueo Fluoróforo. Los cambios en la frecuencia de pico o el área parcial debajo de la curva (pAUC) se calculan frente al tiempo, para cuantificar los efectos observados. pAUC es más sensible y bastante robusto, mientras que la frecuencia de pico proporciona más información sobre el mecanismo de aumento de calcio.

Las subpoblaciones celulares menores se pueden identificar utilizando respuestas funcionales a compuestos marcadores, como la adrenalina y la ghrelina, que inducen cambios en el calcio citosólico en poblaciones específicas de células de isla.

Introduction

El propósito del método es imaginar cambios en tiempo real en la concentración de calcio citosólico ([Ca²⁺]_cyt) en subpoblaciones menores de células de islotes pancreáticos. Esto permite descubrir los mecanismos que rigen la secreción hormonal en estas células, revelando detalles sobre la conversación cruzada entre diferentes tipos de células y, potencialmente, introduciendo una dimensión poblacional en el panorama más amplio de la señalización de islos.

Los islotes constan de varios tipos de celda. Además de las células más conocidas que segregan insulina, hay al menos dos subpoblaciones que también son críticas en la regulación de la glucosa en sangre³. Las células (que componen alrededor del 17% de las células de los islos) secretan el glucagón cuando la glucosa en sangre se vuelve demasiado baja, lo que indica la liberación de glucosa en el torrente sanguíneo desde los depósitos en el hígado. Los niveles excesivos de glucagón (hiperglucagonemia) y el control deteriorado de la liberación de glucagón acompañan (y, técnicamente, pueden contribuir a) la condición prediabética de la sensibilidad a la insulina deteriorada⁴. •Células (alrededor del 2%) secretar somatostatina en respuesta a la elevación de la glucosa. Es probable que esta hormona peptídica ubicua esté presente a altas concentraciones en las proximidades de las células de los islotes, que tiene un fuerte efecto atenuante mediado por el receptor G_i tanto en el glucagón como en la secreción de insulina.

Las células y las células comparten una gran parte de la maquinaria de la sensación de glucosa con sus parientes cercanos del linaje, las células. Los tres tipos de células están equipadas con canales K⁺ sensibles a ATP, sensores metabólicos elaborados⁵ que controlan el potencial de membrana plasmática de estas células excitables. Al mismo tiempo, la secreción de insulina, somatostatina y glucagón está regulada de manera diferente por glucosa. Por lo tanto, la toma de imágenes de la dinámica de Ca²⁺ en las dos subpoblaciones menores de las células de los isletes puede proporcionar una visión de la conversación cruzada entre la glucosa en sangre y la salida del secretor de los islos.

Los primeros intentos de monitorear la excitabilidad de las células de las células de los términos y células mediante la electrofisiología de la abrazadera de parche pronto fueron seguidos por imágenes de Ca²⁺ en células únicas y células. La identidad de las células en estos experimentos se verificó a través de la tinción a posteriori con anticuerpos antiglucagón o anti-somatostatina. Estos esfuerzos con frecuencia se vieron obstaculizados por el hallazgo de que las células del isla se comportan de manera muy diferente dentro del isla y como células individuales. A pesar de que las células de la célula pueden parecer los principales benefactores de la disposición de los islos (debido a su abrumadora mayoría que subyace a su fuerte acoplamiento eléctrico), la principal discrepancia se encontró, sorprendentemente, en las células. Dentro del islet intacto, estas células se activan constantemente y persistentemente a baja glucosa, lo que sólo es cierto para alrededor del 7% de las células dispersas individuales⁶. Por lo tanto, se cree que informar de la actividad de las células de los islotes intactos representa una aproximación más cercana de las condiciones in vivo.

En general, hay dos maneras de informar la dinámica de Ca²⁺ específicamente a partir de las subpoblaciones de células o células: (i) expresar un sensor Ca²⁺ codificado genéticamente a través de un promotor específico del tejido o (ii) utilizando compuestos marcadores. El enfoque anterior más elegante añade la ventaja sustancial de la verdadera imagen 3D y, por lo tanto, el estudio de la distribución celular dentro del iselo. Sin embargo, no se puede aplicar para el material de islet humano intacto. Otra preocupación potencial es la “fuga” del promotor, especialmente cuando la transdiferenciación de las células o la respuesta de las células a la glucosa alta están en su lugar. Este último enfoque se puede utilizar con tejido recién aislado, incluyendo muestras humanas o islotes cultivados. Los datos, sin embargo, se recopilan únicamente de la capa periférica de las células del islet, ya que entregar la molécula de tinte/marcador en capas más profundas sin alterar la arquitectura del islet es un reto. Una ventaja inesperada de este último enfoque es la compatibilidad con el modo de imagen de campo ancho, que permite escalar verticalmente los experimentos a imágenes simultáneas de decenas o cientos de islotes (es decir, miles a decenas de miles de células).

El calcio se imágena in vivo utilizando sensores de familia GCaMP⁷ (o pericam⁸⁾codificados genéticamente, que son variantes de proteína fluorescente verde permutada circularmente (GFP) fusionadas a la proteína de unión al calcio calmodulin y su secuencia diana, fragmento M13 de la quinasa de cadena ligera de miosina^7,9. Los GCAMP tienen excelentes relaciones señal-ruido en el rango de concentraciones nanomolares Ca²⁺ y una alta sección transversal de 2 fotónes, lo que los convierte en una opción ideal para el trabajo in vivo^10,11. El aspecto desafiante del uso de sensores recombinantes es su entrega en las células. La expresión hetróloga requiere el uso de un vector viral y un cultivo ex vivo de varias horas, lo que con frecuencia plantea preocupaciones con respecto a la posible desdiferenciación o deterioro de las funciones celulares. Aunque los modelos de ratón pre-diseñados para expresar GCaMP abordan este problema, añaden nuevos desafíos aumentando el tiempo de entrega sustancialmente y limitando el trabajo a un modelo no humano. La sensibilidad muy alta a los cambios del pH intracelular es otro lado adverso de los sensores basados en proteínas¹², que es, sin embargo, menos un problema para detectar señales oscilatorias, como Ca^2+.

La ventaja de los colorantes trapables (como el fluorescente verde Fluo4) es que se pueden cargar en tejido recién aislado en aproximadamente una hora. Predeciblemente, los colorantes trapense tienen relaciones señal-ruido más bajas y (mucho) menor eslorabilidad que sus contrapartes recombinantes. No podemos confirmar¹³ los informes de toxicidad de los tintes intercambiables¹⁴, sin embargo, la sobrecarga de tinte es un problema frecuente.

Los sensores Rojos Recombinantes Ca²⁺ basados en la permutación circular han estado evolucionando rápidamente desde 2011^15,y los desarrollos más recientes presentan una fuerte competencia a GCaMPs¹⁶ para la toma de imágenes de tejido, dada una mayor profundidad de penetración de la luz roja. Los colorantes intercambiables rojos disponibles en el comercial se pueden utilizar de forma fiable para imágenes de una sola célula, pero, a nivel de tejido, no pueden competir bien con los análogos verdes.

Aparentemente hay muy poca elección de tecnología de imagen para experimentos en tejidos donde la luz desenfocada se convierte en un problema crítico. El sistema confocal proporciona una resolución de una sola célula aceptable mediante la cancelación de la luz fuera de foco con cualquier objetivo en el NA por encima de 0.3 (para el caso de GCaMP6) o 0.8 (tinte intercambiable). En un sentido técnico, un microscopio confocal convencional se puede utilizar para la toma simultánea de imágenes de [Ca²⁺]_cyt de cientos (GCaMP) o decenas de islotes (tinte intercambiable). La única alternativa realista al modo confocal en caso de expresión 3D del sensor en tejido es tal vez microscopía de hoja de luz.

Las cosas son ligeramente diferentes para el caso cuando el sensor se expresa en la capa periférica de las células dentro del tejido del islet. Para sensores recombinantes brillantes que tienen un patrón de expresión intracelular vívido, el uso de un modo de imagen de campo ancho con un objetivo de bajo NA puede proporcionar suficiente calidad y recompensar al investigador con un aumento sustancial en el área de campo de visión y por lo tanto el Rendimiento. Un sistema de campo ancho proporciona una resolución espacial más pobre, ya que la luz desenfocada no se cancela; por lo tanto, el tejido de imágenes con objetivos de alta NA (baja profundidad de campo) es menos informativo, ya que la señal de una sola célula está muy contaminada por las células vecinas. La contaminación es mucho menor para los objetivos de baja NA (alta profundidad de campo).

Sin embargo, hay tareas para las que el alto rendimiento y/o la frecuencia de muestreo se convierten en una ventaja crítica. Las células y células de la clase presentan una heterogeneidad sustancial, lo que crea una demanda de tamaños de muestra altos para revelar la contribución de las subpoblaciones. Las imágenes de campo ancho son rápidas y más sensibles, con un sistema de campo de campo de visión grande a escala industrial cientos (GCaMP) o decenas (Fluo4) de islotes con la misma relación señal-ruido que los experimentos confocales en diez o un solo islotes, respectivamente. Esta diferencia en el rendimiento hace que el sistema de campo ancho sea ventajoso para la creación de imágenes poblacionales con una resolución de una sola célula, lo que puede ser especialmente crítico para subpoblaciones pequeñas, como la de la célula. Del mismo modo, los intentos de reconstruir la actividad eléctrica a partir de Ca²⁺ spiking¹⁷ se beneficiarían de la mayor frecuencia de muestreo proporcionada por un modo de imagen de campo ancho. Al mismo tiempo, varios problemas de “nicho”, como la actividad de las células pancreáticas, tras la estimulación de la subpoblación de células dominantes, requieren el uso de un sistema confocal. Un factor que influye en la decisión hacia el modo confocal es la presencia de una señal contaminante sustancial de la subpoblación de células.

Aunque el uso de la tinción de anticuerpos específicos hormonales para verificar la identidad de las células después de los experimentos de imagen sigue siendo una opción, las subpoblaciones de células menores se pueden identificar utilizando compuestos marcadores funcionales, como la adrenalina y la ghrelina que se demostró para estimular selectivamente la dinámica de Ca²⁺ en las células^{19, 20,}respectivamente.

El análisis de los datos de imágenes de lapso de tiempo tiene como objetivo proporcionar información más allá de la farmacología trivial, como la heterogeneidad poblacional, la correlación y la interacción de diferentes señales. Convencionalmente, los datos de imagen se analizan como intensidad frente al tiempo y se normalizan a la fluorescencia inicial (F/F₀). Con frecuencia se necesita una corrección basal, debido al blanqueo de la señal de fluoróforo o contaminación por cambios en la autofluorescencia o el pH (típicamente inducido por los niveles milimolares de glucosa^12). Los datos de Ca²⁺ se pueden analizar de muchas maneras diferentes, pero tres tendencias principales son medir los cambios en la frecuencia del pico, la fracción de la meseta o el área debajo de la curva, calculado frente al tiempo. Encontramos este último enfoque ventajoso, especialmente en aplicación a datos confocales muy submuestreados. La ventaja de la métrica pAUC es su sensibilidad tanto a los cambios en la frecuencia y amplitud de la señal, mientras que calcular la frecuencia requiere un número sustancial de oscilaciones^21,que es difícil de lograr utilizando imágenes convencionales. El factor limitante del análisis pAUC es su alta sensibilidad a los cambios de línea de base.

Protocol

Todos los métodos descritos aquí fueron desarrollados de acuerdo con la Ley de Animales del Reino Unido (Procedimientos Científicos) (1986) y las directrices éticas de la Universidad de Oxford. 1. Aislar los islotes pancreáticos del ratón Prepare el medio de cultivo y la solución de aislamiento. Componer el medio de cultivo: RMPI1640 (ver Tabla de Materiales),complementado con 10% de suero de ternera fetal, 100 unidades/ml de penicilina, 100 g/ml de es…

Representative Results

Los islotes se cargan bastante bien con los colorantes trapables(Figura 1A),a menos que la composición lipídica de la membrana se haya visto afectada (por ejemplo, por la exposición crónica a ácidos grasos). El vector de adenovirus humano tipo 5 (Ad5) también se dirige a todas las células de los islos(Figura 1B). Pueden surgir problemas cuando se está expresando más de un sensor recombinante en la misma célula. Además…

Discussion

Hay tres etapas en el protocolo que son críticas para el éxito general. La inyección exitosa de la enzima Liberase en el conducto biliar determina no sólo el éxito cuantitativo del procedimiento de aislamiento, sino que también afecta la calidad de los islotes aislados. La páncreata no inflada puede resultar en la falta de algunas respuestas metabólicas importantes en los islotes aislados. En segundo lugar, la carga del tinte/la expresión del sensor define la relación señal-ruido de la grabación de lapso de t…

Materials

40x/1.3 objective
Axiovert 200 microscope
emission
Excitation
Fetal bovine serum	Sigma-Аldrich	F7524-500ML
Fluo4	ThermoFisher (Life Technologies)	F14201
GCaMP6f, in (human type 5) adenoviral vector	Vector Biolabs	1910
Hanks' solution	ThermoFisher (GibCo, Life Technologies)
Liberase	Sigma-Аldrich	5401020001
penicillin/streptomycin	ThermoFisher (GibCo, Life Technologies)	15140122
RPMI medium	ThermoFisher (GibCo, Life Technologies)	61870044
Zeiss LSM510-META confocal system	Carl Zeiss