Изображение динамики кальция в субпопуляциях мышей поджелудочной железы клеток на икры

Summary

Здесь мы представляем протокол для визуализации и количественной оценки динамики кальция в неоднородных популяциях клеток, таких как клетки островков поджелудочной железы. Флуоресцентные репортеры поставляются в периферийный слой клеток внутри наиксхота, который затем обездвиживается и образуется, и на одного клетка проводится анализ динамики интенсивности флуоресценции.

Abstract

Гормоны островков поджелудочной железы регулируют гомеостаз глюкозы в крови. Изменения в глюкозе в крови вызывают колебания цитозоля кальция в клетках поджелудочной железы, которые вызывают секрецию трех основных гормонов: инсулина (из клеток), глюкагона (я-клеток) и соматостатина (я-клетки). Клетки, которые составляют большинство клеток-излиемжителей и электрически связаны друг с другом, реагируют на стимул глюкозы как единое целое. Возбудимость незначительных субпопуляций, я-клеток и к-клеток (составляет около 20% (30%) и 4% (10%) общего числа грызунов¹ (человек²) номера клеток аклетов, соответственно) является менее предсказуемым и, следовательно, представляет особый интерес.

Датчики кальция поставляются в периферийный слой клеток в изолированном изолированном изолированном изолированном изолированном изолированном раздатчике. Островок или группа островков затем обездвижены и изображены с помощью флуоресцентного микроскопа. Выбор режима визуализации находится между более высокой пропускной стоимостью (широкое поле) и лучшим пространственным разрешением (конфокальным). Условно, лазерное сканирование конфокальной микроскопии используется для визуализации тканей, так как она обеспечивает лучшее разделение сигнала между соседними клетками. Можно также использовать широкополевой систему, если свести к минимуму загрязняющий сигнал от доминирующей популяции к-клеток.

После того, как динамика кальция в ответ на конкретные стимулы были зарегистрированы, данные выражаются в численной форме, как интенсивность флуоресценции по сравнению со временем, нормализованы к первоначальной флуоресценции и базовые коррекции, чтобы удалить эффекты, связанные с отбеливанием фторофор. Изменения частоты спаза или частичной области под кривой (pAUC) вычисляются по сравнению со временем, для количественной оценки наблюдаемых эффектов. PAUC является более чувствительным и довольно надежным в то время как частота пикирования обеспечивает больше информации о механизме увеличения кальция.

Незначительные субпопуляции клеток могут быть определены с помощью функциональных реакций на маркер соединений, таких как адреналин и грелин, которые вызывают изменения в цитосолико кальция в конкретных популяциях клеток-разыски.

Introduction

Целью метода является изображение изменений в реальном времени в концентрации цитосолика кальция (Ca^{2 и}_cyt) в небольших субпопуляциях клеток поджелудочной железы. Это позволяет раскрыть механизмы, регулирующие секрецию гормонов в этих клетках, раскрывая детали о перекрестном разговоре между различными типами клеток и, потенциально, вводя измерение населения в более широкую картину сигнализации на изовсехили.

Островки состоят из нескольких типов клеток. Помимо более известных инсулиноседающих клеток, есть по крайней мере две субпопуляции, которые также имеют решающее значение в регулировании глюкозы в крови³. К-Клетки (которые составляют около 17% клеток газолетов) выделяют глюкагон, когда уровень глюкозы в крови становится слишком низким, что сигнализирует о высвобождении глюкозы в кровоток из складов в печени. Чрезмерный уровень глюкагона (гиперглукогонония) и нарушение контроля глюкагона-релиза сопровождают (и, технически, могут способствовать) предиабетическое состояние нарушения чувствительности инсулина⁴. К-Клетки (около 2%) выделяют соматостатин в ответ на повышение уровня глюкозы. Этот вездесущий пептидный гормон, вероятно, присутствует при высоких концентрациях в непосредственной близости от клеток в островках, который имеет сильное G_i рецепторо-опосредованного затмения на глюкагон и секрецию инсулина.

Я-Клетки и клетки разделяют большую часть механизма зондирования глюкозы с их близкими родственниками, клетками. Все три типа клеток оснащены аТПл-чувствительными каналами^K, сложными метаболическими датчиками^5, которые контролируют потенциал плазменной мембраны этих возбудимых клеток. В то же время, секреция инсулина, соматостатина и глюкагона регулируется по-разному глюкозой. Таким образом, визуализация динамики Ca^{2 в} двух незначительных субпопуляциях клеток-аклетов может дать представление о перекрестном разговоре между глюкозой крови и выходом на просторы.

Ранние попытки мониторинга возбудимости я- и q-клеток с помощью патч-зажим электрофизиологии вскоре последовали изображения Ca^{2 “в} одном – и й-клеток. Идентичность клеток в этих экспериментах была проверена с помощью заднего окрашивания анти-глюкагоном или анти-соматостатин антитела. Эти усилия часто затруднялись выводом о том, что в пределах простота и как одиночные клетки ведут себя очень по-разному. Хотя к-клетки могут показаться главными благодетелями расположения на иктов (из-за их подавляющего большинства, которое лежит в основе их сильной электрической связи), основное несоответствие было, что удивительно, было обнаружено в клетках. В нетронутом наиклете эти клетки постоянно и настойчиво активируются при низкой глюкозе, что верно только для около 7% отдельных рассеянных^6. Таким образом, считается, что сообщение о активности я-и-клеток в нетронутых островках представляет собой более близкое приближение условий in vivo.

В целом, существует два способа отчетности Ca^{2 “динамики} конкретно от ячеек или я-клеток субпопуляций: (i) выражение генетически закодированных Датчик Ca^{2 “} через ткани конкретных промоутер или (ii) с использованием маркера соединений. Более элегантный прежний подход добавляет существенное преимущество истинного 3D-изображения и, следовательно, изучения распределения клеток в пределах наикса. Однако он не может быть применен для нетронутого человеческого газолетного материала. Другой потенциальной проблемой является «утечка» промоутера, особенно когда существует трансдифферециация к/-х-клеток или реакция на высокий уровень глюкозы. Последний подход может быть использован со свежеизолилой ткани, включая образцы человека или культивированных островков. Данные, однако, собираются исключительно из периферического слоя клеток аклетов, так как доставка молекулы красителя/маркера в более глубокие слои без изменения архитектуры на дорогах является сложной задачей. Неожиданным преимуществом последнего подхода является совместимость с широкоугольным режимом визуализации, что позволяет масштабировать эксперименты для одновременного изображения десятков или сотен островков (т.е. от тысяч до десятков тысяч клеток).

Кальций изображен в vivo с помощью генетически закодированных GCAMP⁷ (или перикам8) семейные датчики, которые являются вариантами круговой пермутентного зеленого флуоресцентного белка (GFP) сливается с кальцием-связывающий белок calmodulin и его целевой последовательности, M13 фрагмент миозина свет цепи киназы^7,9. GCaMPs имеют превосходные соотношения сигнала к шуму в диапазоне концентраций наномоллярного Ca^{2 и} высокое 2-фотон поперечное сечение, что делает их идеальным выбором для работы in vivo^10,11. Сложным аспектом использования рекомбинантных датчиков является их доставка в клетки. Гетерологические выражения требует использования вирусного вектора и многочасового ex vivo культивирования, что часто вызывает озабоченность в связи с потенциальной дедифференциацией или ухудшением функций клеток. Хотя модели мыши предварительно разработаны, чтобы выразить GCaMP решить эту проблему, они добавляют новые проблемы, увеличивая время работы существенно и ограничивая работу нечеловеческой модели. Очень высокая чувствительность к изменениям внутриклеточного рН является еще одной неблагоприятной стороной белковых датчиков¹², что, однако, меньше проблем для зондирования колеблющихся сигналов, таких как Ca^{2 “}.

Преимущество ловушки красителей (таких как зеленый флуоресцентный Fluo4) является то, что они могут быть загружены в свежеизолаженной ткани в течение часа. Как и следовало ожидать, ловушки красители имеют более низкие соотношения сигнала к шуму и (гораздо) ниже фотостабильности, чем их рекомбинантные аналоги. Мы не можем подтвердить¹³ сообщений о токсичности ловушки красителей¹⁴, однако, красителя перегрузки является частой проблемой.

Красный рекомбинантных датчиков Ca^{2 “на} основе круговой перестановки быстро развиваются с 2011¹⁵, и самые последние события представляют собой сильную конкуренцию GCaMPs¹⁶ для визуализации тканей, учитывая более высокую глубину проникновения красного света. Коммерчески доступные красные рекреты могут быть надежно использованы для одноклеточного изображения, но, на уровне тканей, не может хорошо конкурировать с зелеными аналогами.

Существует, казалось бы, очень мало выбора технологии визуализации для экспериментов в тканях, где вне фокуса свет становится критической проблемой. Конфокальная система обеспечивает приемлемое одноклеточное разрешение путем отмены внефокусного света с любой целью на NA выше 0.3 (в случае GCaMP6) или 0.8 (ловушка красителя). В техническом смысле, обычный конфокальный микроскоп может быть использован для одновременного изображения «Ca^2»_cyt из сотен (GCaMP) или десятков островков (ловушке красителя). Единственной реалистичной альтернативой конфокального режима в случае 3D-выражения датчика в тканях, возможно, является светолистовая микроскопия.

Вещи немного отличаются в случае, когда датчик выражается в периферийном слое клеток в области области области, а также для области. Для ярких рекомбинантных датчиков, которые имеют яркий внутриклеточный рисунок выражения, использование широкоугольного режима визуализации с целью с низким уровнем NA может обеспечить достаточное качество и вознаградить исследователя значительным увеличением области поля зрения и, следовательно, Пропускной способности. Широкополевой системы обеспечивает более слабое пространственное разрешение, так как свет вне фокуса не отменяется; поэтому визуализация тканей с высокой na (низкой глубиной резкости) целей является менее информативным, так как одноклеточный сигнал значительно загрязнен соседними клетками. Загрязнение гораздо меньше для целей с низким уровнем na (высокая глубина поля).

Однако существуют задачи, для которых высокая пропускная информация и/или частота выборки становятся критическим преимуществом. Кеты и к-клетки обладают существенной неоднородностью, что создает спрос на высокие размеры выборки, чтобы выявить вклад субпопуляций. Широкоугольное изображение является быстрым и более чувствительным, с промышленным масштабом большой поле зрения системы визуализации сотни (GCaMP) или десятки (Fluo4) островков в том же соотношении сигнала к шуму, как конфокальные эксперименты на десяти или одного островка, соответственно. Эта разница в пропускной связи делает широкополевую систему выгодной для визуализации населения с одноклеточным разрешением, что может быть особенно важным для небольших субпопуляций, таких как кон-клеточный. Аналогичным образом, попытки реконструировать электрическую активность от Ca^{2 ‘spiking 17} выиграют от более высокой частоты отбора проб, обеспечиваемых широкоугольным режимом визуализации. В то же время, несколько “нишевых” проблем, таких как активность поджелудочной железы и клеток при стимуляции доминирующей субпопуляции клеток, требуют использования конфокальной системы. Фактором, влияющим на решение о конфокальном режиме, является наличие существенного загрязняющих сигнала от субпопуляции к-клеток.

Хотя использование гормона конкретных антител окрашивания для проверки личности клеток после визуализации экспериментов по-прежнему вариант, незначительные субпопуляции клеток могут быть определены с помощью функциональных соединений маркера, таких как адреналин и грелин, которые были показаны избирательно стимулировать Динамику Ca^{2 “в No- 18} и No-клеток^19,20, соответственно.

Анализ данных по замедленной визуализации направлен на предоставление информации, выходящих за рамки тривиальной фармакологии, такой как популяционная неоднородность, корреляция и взаимодействие различных сигналов. Условно, данные изображения анализируются как интенсивность по сравнению со временем и нормализуется до первоначальной флуоресценции (F/F₀). Базовая коррекция часто необходима, в связи с обесцвечиванием сигнала фторрора или загрязнения изменениями в автофлюоресценции или рН (обычно индуцированных миллимолярных уровней глюкозы¹²). Данные Ca^{2 могут} быть проанализированы по-разному, но три основные тенденции – это измерение изменений частоты спаеля, фракции плато или области под кривой, вычисленном по сравнению с временем. Мы сочли последний подход выгодным, особенно в применении к сильно недовыборным конфокальных данным. Преимуществом метрики PAUC является ее чувствительность к изменениям частоты сигнала и амплитуды, в то время как вычисление частоты требует значительного количества колебаний²¹, что трудно достичь с помощью обычных изображений. Ограничивающим фактором анализа PAUC является его высокая чувствительность к базовым изменениям.

Protocol

Все описанные здесь методы были разработаны в соответствии с Законом Соединенного Королевства о животных (научные процедуры) (1986 год) и этическими руководящими принципами Оксфордского университета. 1. Изолят мышонковые островки поджелудочной железы Подготовьте ку…

Representative Results

Островки загружаются довольно хорошо с ловушками красителей(Рисунок 1А), если липидный состав мембраны был затронут (например, в результате хронического воздействия жирных кислот). Вектор аденовируса человека типа 5 (Ad5) также нацелен на все клеток-разыскных зай…

Discussion

В протоколе есть три этапа, которые имеют решающее значение для общего успеха. Успешная инъекция фермента Liberase в желчный проток определяет не только количественный успех процедуры изоляции, но и влияет на качество изолированных островков. Нераздутая панкреата может привести к отсутст…

Materials

40x/1.3 objective
Axiovert 200 microscope
emission
Excitation
Fetal bovine serum	Sigma-Аldrich	F7524-500ML
Fluo4	ThermoFisher (Life Technologies)	F14201
GCaMP6f, in (human type 5) adenoviral vector	Vector Biolabs	1910
Hanks' solution	ThermoFisher (GibCo, Life Technologies)
Liberase	Sigma-Аldrich	5401020001
penicillin/streptomycin	ThermoFisher (GibCo, Life Technologies)	15140122
RPMI medium	ThermoFisher (GibCo, Life Technologies)	61870044
Zeiss LSM510-META confocal system	Carl Zeiss