Avbildning Kalciumdynamik i subpopulationer av mus bukspottskörteln ö-celler

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för avbildning och kvantifiering av kalciumdynamik i heterogena cellpopulationer, till exempel pankreasceller. Fluorescerande reportrar levereras i det perifera lagret av celler inom Holmen, som sedan immobiliseras och avbildas, och per cell analys av dynamiken i fluorescensintensiteten utförs.

Abstract

Bukspottskörteln holhormoner reglera blodglukos homeostas. Förändringar i blodsocker inducera svängningar av cytosoliskt kalcium i bukspottskörteln ö-celler som utlöser utsöndring av tre huvudsakliga hormoner: insulin (från β-celler), glukagon (α-celler) och somatostatin (δ-celler). β-celler, som utgör majoriteten av ö-celler och är elektriskt kopplade till varandra, svara på glukos stimulans som en enda enhet. Retbarhet av de mindre subpopulationerna, α-cellerna och δ-cellerna (som utgör cirka 20% (30%) och 4% (10%) av den totala gnagare¹ (Human²) ö-cellnummer, respektive) är mindre förutsägbar och är därför av särskilt intresse.

Kalcium sensorer levereras i det perifera lagret av celler inom den isolerade Holmen. Ön eller en grupp av holkar immobiliseras sedan och avbildas med hjälp av ett fluorescensmikroskop. Valet av Imaging-läge är mellan högre dataflöde (Wide-fält) och bättre rumslig upplösning (konfokal). Konventionellt, laserskanning konfokalmikroskopi används för avbildning vävnad, eftersom det ger den bästa separationen av signalen mellan angränsande celler. Ett Wide-Field system kan utnyttjas för, om kontaminating signalerar från den dominera befolkningen av β-celler minimeras.

När kalciumdynamiken som svar på specifika stimuli har registrerats uttrycks data i numerisk form som fluorescensintensitet kontra tid, normaliserad till initial fluorescens och baseline-korrigerad, för att avlägsna effekterna kopplade till blekning av fluorophore. Förändringar i Spike frekvens eller delområde under kurvan (pAUC) beräknas kontra tid, att kvantifiera de observerade effekterna. PAUC är känsligare och ganska robust medan tillsatta frekvens ger mer information om mekanismen för kalcium ökning.

Mindre cell subpopulationer kan identifieras med hjälp av funktionella svar på markör föreningar, såsom adrenalin och ghrelin, som inducerar förändringar i cytosoliskt kalcium i en viss population av ö-celler.

Introduction

Syftet med metoden är att avbilda realtids förändringar i cytosoliska kalciumkoncentration ([ca^{2 +}]_CYT) i mindre subpopulationer av bukspottskörteln ö-celler. Detta gör att avslöja mekanismerna för hormon sekretion i dessa celler, avslöjar Detaljer om Cross-Talk mellan olika celltyper och, potentiellt, införa en populational dimension i den större bilden av Holmen signalering.

Islets består av flera celltyper. Förutom de mer välkända insulin-utsöndringen β-celler, det finns minst två subpopulationer som också är kritiska i regleringen av blodsocker³. α-celler (som utgör cirka 17% av ö-celler) utsöndrar glukagon när blodsockret blir för lågt, vilket signalerar för frisättning av glukos i blodet från depåer i levern. Överdriven glukagon nivåer (hyperglucagonemi) och försämrad kontroll av glukagon-release åtfölja (och, tekniskt, kan bidra till) den prediabetic tillstånd av nedsatt insulinkänslighet⁴. δ-celler (cirka 2%) utsöndrar somatostatin som svar på glukos förhöjning. Detta allestädande peptid hormon är sannolikt närvarande vid höga koncentrationer i närheten av α-och β-celler i holkar, som har en stark G_i receptor-medierad dämpande effekt på både glukagon och insulinsekretion.

α-celler och δ-celler delar en stor del av glukos Avkännings maskineriet med sina nära släkt, β-celler. Alla tre celler typer är utrustade med ATP-känsliga K⁺ kanaler, utarbeta metaboliska sensorer⁵ som styr plasmamembranet potential dessa retbara celler. Samtidigt regleras utsöndringen av insulin, somatostatin och glukagon på olika sätt av glukos. Avbildning av ca^{2 +} dynamik i de två mindre subpopulationerna av ö-celler kan därför ge en inblick i Cross-Talk mellan blodglukos och Holmen sekretoriska produktionen.

Tidiga försök att övervaka retbarheten av α-och δ-celler med hjälp av plåster-klämma elektrofysiologi följdes snart av avbildning av ca^{2 +} i enstaka α-och δ-celler. Cellernas identitet i dessa experiment kontrollerades i efterhand med anti-glukagon-eller anti-somatostatin-antikroppar. Dessa ansträngningar hämmades ofta av konstaterandet att ö-celler beter sig mycket annorlunda inom Holmen och som enstaka celler. Även om β-celler kan tyckas vara de viktigaste välgörare av Holmen arrangemanget (på grund av sin överväldigande majoritet som ligger bakom deras starka elektriska kopplingen), den största avvikelsen var, överraskande, hittades i α-celler. Inom den intakt holme, dessa celler ständigt och ihållande aktiveras vid låga glukos, vilket är bara sant för cirka 7% av enstaka dispergerade α-celler⁶. Att rapportera aktiviteten hos α-och δ-celler i intakta öar tros därför utgöra en närmare tillnärmning av in vivo-förhållanden.

I allmänhet finns det två sätt att rapportera ca^{2 +} dynamik specifikt från α-cell-eller δ-cellsunderpopulationerna: (i) att uttrycka en genetiskt kodad ca^{2 +} -sensor via en vävnadsspecifik promotor eller (II) använda markör föreningar. Den mer eleganta tidigare metoden lägger den stora fördelen av sann 3D-avbildning och därmed studerar cell distribution inom Holmen. Det kan dock inte tillämpas för intakt Human Holmen material. En annan potentiell angelägenhet är Promotorns “läckage”, särskilt när β-/α-cells transdifferentieringen eller α-cellsreaktionen på hög glukos är på plats. Den sistnämnda metoden kan användas med färsk isolerad vävnad, inklusive mänskliga prover eller odlade öar. Data samlas dock endast från det perifera lagret av ö-celler, som levererar färgämne/markör molekyl i djupare lager utan att förändra Holmen arkitektur är utmanande. En oväntad fördel med den senare metoden är kompatibiliteten med Bredbildsläge, vilket gör det möjligt att skala upp experimenten till samtidig avbildning av tiotals eller hundratals öar (dvs. tusentals till tiotusentals celler).

Kalcium är avbildat i vivo med hjälp av genetiskt kodade gcamp⁷ (eller pericam⁸) familj sensorer, som är varianter av cirkulärt permuterade grönt fluorescerande protein (GFP) smält till kalcium-bindande protein calmodulin och dess målsekvens, M13 fragment av myosin ljus kedja Kinas^7,9. Gcamps har superb signal-till-brus nyckeltal i intervallet nanomolar ca^{2 +} koncentrationer och en hög 2-Photon tvärsnitt, vilket gör dem till ett idealiskt val för in vivo arbete^10,11. Den utmanande aspekten av att använda rekombinanta sensorer är deras leverans till cellerna. Heterologt uttryck kräver användning av en viral vektor och flera timmar ex vivo odling, som ofta väcker farhågor om potentiell avdifferentiering eller försämring av cellfunktioner. Även om musmodeller förkonstruerade för att uttrycka GCaMP ta itu med detta problem, de lägger till nya utmaningar genom att öka ledtiden avsevärt och begränsa arbetet till en icke-mänsklig modell. Mycket hög känslighet för förändringar av intracellulära pH är en annan negativ sida av proteinbaserade sensorer¹², vilket dock är mindre av ett problem för avkänning oscillerande signaler, såsom ca^{2 +}.

Fördelen med trap-färgämnen (såsom grön fluorescerande Fluo4) är att de kan lastas i färsk isolerad vävnad inom cirka en timme. Förutsägbart, trap-färgämnen har lägre signal-brus-förhållanden och (mycket) lägre foto stabilitet än deras rekombinanta motsvarigheter. Vi kan inte bekräfta¹³ rapporterna om toxicitet av de trap-färgämnen¹⁴, men färg överlastning är ett vanligt problem.

Röda, rekombinanta ca^{2 +} -sensorer baserade på cirkulär permutation har utvecklats snabbt sedan 2011¹⁵, och de senaste utvecklingarna utgör en stark konkurrens till gcamps¹⁶ för vävnads avbildning, givet högre penetrationsgrad av rött ljus. Kommersiellt tillgängliga röda trap färger kan användas på ett tillförlitligt sätt för Single-cell Imaging, men på vävnadsnivå, kan inte konkurrera väl med de gröna analoger.

Det finns till synes väldigt lite val av bildteknik för experiment i vävnad där out-of-Focus ljus blir ett kritiskt problem. Den konfokalmikroskopi systemet ger acceptabel Single-cell upplösning genom annullering av out-of-fokus ljus med alla mål på Na ovan 0,3 (för fallet med GCaMP6) eller 0,8 (trap färg). I en teknisk bemärkelse, en konventionell konfokala Mikroskop kan användas för samtidig avbildning av [ca^{2 +}]_CYT från hundratals (gcamp) eller tiotals öar (trappable Dye). Det enda realistiska alternativet till konfokalläge vid 3D-uttryck av sensorn i vävnad är kanske ljusbladsmikroskopi.

Saker är något annorlunda för fallet när sensorn uttrycks i det perifera lagret av celler inom Holmen vävnad. För ljusa rekombinanta sensorer som har ett levande intracellulärt uttrycksmönster, med hjälp av ett brett fält bildhanterings läge med ett låg-NA-mål kan ge tillräcklig kvalitet och belöna forskaren med en betydande ökning inom synfälts området och därmed Genomströmning. Ett brett fält system ger sämre rumslig upplösning, eftersom ljuset utanför fokus inte avbryts. Därför bild vävnad med hög-NA (låg skärpedjup) mål är mindre informativ, som Single-cell signalen är kraftigt förorenad av angränsande celler. Föroreningen är mycket mindre för låg-NA (hög skärpedjup) mål.

Det finns dock uppgifter för vilka ett högt dataflöde och/eller samplingsfrekvens blir en kritisk fördel. α-och δ-celler uppvisar betydande heterogenitet, vilket skapar en efterfrågan på höga urvalsstorlekar för att avslöja subpopulationernas bidrag. Wide-fält Imaging är snabb och känsligare, med en industriell skala stora synfält systemavbildning hundratals (GCaMP) eller tiotals (Fluo4) av öar vid samma signal-brus-förhållande som de konfokala experiment på tio eller en enda Holmen, respektive. Denna skillnad i genomströmningen gör wide-fältet systemet fördelaktigt för populational Imaging med en enda cell upplösning, vilket kan vara särskilt viktigt för små subpopulationer såsom δ-cell en. Likaså skulle försök att rekonstruera elektrisk aktivitet från ca^{2 +} tillsatta¹⁷ gynnas av den högre samplingsfrekvens som tillhandahålls av ett brett fält Imaging-läge. Samtidigt, flera “nisch” problem som aktiviteten av bukspottskörteln α-celler vid stimulering av den dominerande β-cell subpopulation, kräver användning av ett konfokalsystem. En faktor som påverkar beslutet mot konfokalläge är närvaron av betydande kontaminerande signal från β-cell subpopulation.

Även om du använder hormonspecifik antikropps färgning för att verifiera cellernas identitet efter att bild försöken fortfarande är ett alternativ, kan mindre cell subpopulationer identifieras med hjälp av funktionella markör föreningar, såsom adrenalin och ghrelin som visades selektivt stimulera ca^{2 +} dynamik i α-¹⁸ och δ-celler^19,20respektive.

Analysen av tidsfördröjning Imaging data syftar till att ge information utöver triviala farmakologi, såsom populational heterogenitet, korrelation och interaktion mellan olika signaler. Konventionellt analyseras bild data som intensitet kontra tid och normaliseras till den initiala fluorescensen (F/F₀). Baseline korrigering behövs ofta, på grund av blekning av fluorophore signalen eller förorening genom förändringar i autofluorescence eller pH (typiskt induceras av millimolar nivåer av glukos¹²). Ca^{2 +} data kan analyseras på många olika sätt, men tre huvudsakliga trender är att mäta förändringar i Spike frekvens, platå fraktion, eller område under kurvan, beräknad kontra tid. Vi fann det sistnämnda tillvägagångssättet fördelaktigt, särskilt i tillämpningen av kraftigt undersamplade konfokaldata. Fördelen med den pAUC metriska är dess känslighet för både förändringar i signal frekvens och amplitud, medan Computing frekvensen kräver ett stort antal svängningar²¹, vilket är svårt att uppnå med konventionell avbildning. Den begränsande faktorn för pAUC-analys är dess höga känslighet för baseline-förändringar.

Protocol

Alla metoder som beskrivs här har utvecklats i enlighet med Förenade kungarikets djur (Scientific procedurer) Act (1986) och University of Oxford etiska riktlinjer. 1. isolera mus pankreasöar Förbered odlingsmediet och isolerings lösningen. Utgör odlingsmediet: RMPI1640 (se tabell över material), kompletterat med 10% av fetalt kalv serum, 100 enheter/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin. Fördela mediet i 2 60 mm plast petriskålar (som inte behandla…

Representative Results

Holkar belastning ganska bra med de trap färgämnen (figur 1A), om inte lipidsammansättningen av membranet har påverkats (t. ex. genom kronisk exponering för fettsyror). Den humana adenovirus typ 5 (Ad5)-vektorn riktar sig också till alla ö-celler (figur 1B). Problem kan uppstå när mer än en rekombinant sensor uttrycks i samma cell. Dessutom är holmar vanligtvis mycket väl immobiliserade med hjälp av den teknik som b…

Discussion

Det finns tre stadier i protokollet som är avgörande för den totala framgången. En lyckad injektion av enzymet Liberase i gallgången bestämmer inte bara den kvantitativa framgången för isolerings förfarandet utan också påverkar kvaliteten på de isolerade holarna. Ouppblåst pancreata kan resultera i brist på några viktiga metaboliska svar i de isolerade öarna. För det andra, lastning av färgämnet/uttrycket av sensorn definierar signal-brus-förhållandet i tidsfördröjning inspelningen. Signalerna är …

Materials

40x/1.3 objective
Axiovert 200 microscope
emission
Excitation
Fetal bovine serum	Sigma-Аldrich	F7524-500ML
Fluo4	ThermoFisher (Life Technologies)	F14201
GCaMP6f, in (human type 5) adenoviral vector	Vector Biolabs	1910
Hanks' solution	ThermoFisher (GibCo, Life Technologies)
Liberase	Sigma-Аldrich	5401020001
penicillin/streptomycin	ThermoFisher (GibCo, Life Technologies)	15140122
RPMI medium	ThermoFisher (GibCo, Life Technologies)	61870044
Zeiss LSM510-META confocal system	Carl Zeiss