Dinâmica de cálcio de imagem em subpopulações de células de ilhotas pancreáticas do rato

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para imagens e quantificar a dinâmica do cálcio em populações heterogêneas de células, como células de ilhotas pancreáticas. Os repórteres fluorescentes são entregues na camada periférica de células dentro da ilhota, que é então imobilizada e imagemda, e a análise por célula da dinâmica da intensidade da fluorescência é realizada.

Abstract

Hormônios das ilhotas pancreáticas regulam a homeostase de glicose no sangue. Alterações na glicose no sangue induzem oscilações de cálcio citosólico em células de ilhotas pancreáticas que desencadeiam a secreção de três hormônios principais: insulina (de células β), glucagon (α-células) e somatostatina (células δ). β-Células, que compõem a maioria das células ilhotas e são eletricamente acoplados uns aos outros, respondem ao estímulo da glicose como uma única entidade. A excitabilidade das subpopulações menores, das células α e das células-δ (representando cerca de 20% (30%) e 4% (10%) do total de roedores¹ (humano²⁾números de células ilhotas, respectivamente) é menos previsível e, portanto, é de interesse especial.

Sensores de cálcio são entregues na camada periférica de células dentro da ilhota isolada. A ilhota ou um grupo de ilhotas é então imobilizada e imagem usando um microscópio de fluorescência. A escolha do modo de imagem está entre maior taxa de rendimento (wide-field) e melhor resolução espacial (confocal). Convencionalmente, a microscopia confocal da exploração do laser é usada para o tecido da imagem latente, porque fornece a melhor separação do sinal entre as pilhas vizinhas. Um sistema de campo largo também pode ser utilizado, se o sinal de contaminação da população dominante de células β for minimizado.

Uma vez registrada a dinâmica do cálcio em resposta a estímulos específicos, os dados são expressos em forma numérica como intensidade de fluorescência versus tempo, normalizados para a fluorescência inicial e corrigidos na linha de base, para remover os efeitos ligados ao branqueamento fluorofofóbico. As alterações na frequência de picos ou na área parcial a curva (pAUC) são computadas versus tempo, para quantificar os efeitos observados. PAUC é mais sensível e bastante robusto, enquanto a frequência de aumento fornece mais informações sobre o mecanismo de aumento de cálcio.

Subpopulações celulares menores podem ser identificadas usando respostas funcionais a compostos de marcadores, como adrenalina e grelina, que induzem alterações no cálcio citosólico em populações específicas de células ilhotas.

Introduction

O objetivo do método é a imagem em tempo real mudanças na concentração citossólica de cálcio ([Ca^{2 +}]_cyt) em subpopulações menores de células de ilhotas pancreáticas. Isso permite descobrir os mecanismos que regem a secreção hormonal nessas células, revelando detalhes sobre a conversa cruzada entre diferentes tipos de células e, potencialmente, introduzindo uma dimensão populational na imagem maior da sinalização de ilhotas.

Ilhotas consistem em vários tipos de células. Além das células β-secretadas mais conhecidas pela insulina, há pelo menos duas subpopulações que também são críticas na regulação da glicose no sangue^3. α-Células (que compõem cerca de 17% das células ilhotas) secretam glucagon quando a glicose no sangue fica muito baixa, o que sinaliza para a liberação de glicose na corrente sanguínea a partir de depósitos no fígado. Níveis excessivos de glucagon (hiperlucagonemia) e controle prejudicado da liberação de glucagon acompanham (e, tecnicamente, pode contribuir para) a condição pré-diabética da sensibilidade à insulina prejudicada⁴. δ-Células (cerca de 2%) secretar somatostatina em resposta à elevação da glicose. Este hormônio peptídeo onipresente é susceptível de estar presente em altas concentrações nas proximidades de α- e β-células dentro ilhotas, que tem um forte G_i receptor mediado efeito atenuante em glucagon e secreção de insulina.

α-Células e células-δ compartilham uma grande parte da maquinaria de detecção de glicose com seus parentes de linhagem próxima, células β. Todos os três tipos de células estão equipados com canais K⁺ sensíveis ao ATP, sensores metabólicos elaborados⁵ que controlam o potencial de membrana plasmática dessas células excitáveis. Ao mesmo tempo, a secreção de insulina, somatostatina e glucagon é regulada de forma diferente pela glicose. A imagem latente da dinâmica de Ca²⁺ nas duas subpopulações menores de pilhas da ilhota pode conseqüentemente fornecer uma introspecção na cruz-conversa entre a glicose de sangue e a saída secretory da ilhota.

As primeiras tentativas de monitorar a excitabilidade das células α e δ usando eletrofisiologia de grampo de remendo foram logo seguidas por imagens de Ca²⁺ em células α e δ únicas. A identidade das células nesses experimentos foi verificada através de uma coloração posterior com anticorpos anti-glucagon ou anti-somatostatina. Estes esforços foram frequentemente dificultados pela constatação de que as células ilhotas se comportam de forma muito diferente dentro da ilhota e como células únicas. Embora as células β pareçam ser os principais benfeitores do arranjo das ilhotas (devido à sua esmagadora maioria subjacente ao seu forte acoplamento elétrico), a principal discrepância foi, surpreendentemente, encontrada nas células α. Dentro da ilhota intacta, estas células são constantemente e persistentemente ativadas em baixa glicose, o que só é verdade para cerca de 7% das únicas células α dispersas⁶. Acredita-se, portanto, que relatar a atividade das células α e δ dentro de ilhotas intactas represente uma aproximação mais próxima das condições in vivo.

Em geral, existem duas maneiras de relatar a dinâmica Ca²⁺ especificamente das subpopulações α-célula ou células-δ: (i) expressando um sensor Ca²⁺ geneticamente codificado através de um promotor específico do tecido ou (ii) usando compostos de marcadores. A abordagem anterior mais elegante acrescenta a vantagem substancial da verdadeira imagem 3D e, portanto, o estudo da distribuição celular dentro da ilhota. No entanto, não pode ser aplicado para material intacto de ilhota humana. Outra preocupação potencial é o ‘vazamento’ do promotor, particularmente quando a transdiferenciação β/α-célula ou a resposta de células α à alta glicose está em vigor. Esta última abordagem pode ser usada com tecido recém-isolado, incluindo amostras humanas ou ilhotas cultivadas. Os dados, no entanto, são coletados exclusivamente da camada periférica de células ilhotas, pois a entrega da molécula de tintura/marcador em camadas mais profundas sem alterar a arquitetura da ilhota é desafiadora. Uma vantagem inesperada desta última abordagem é a compatibilidade com o modo de imagem de campo largo, que permite a ampliação dos experimentos para imagens simultâneas de dezenas ou centenas de ilhotas (ou seja, milhares a dezenas de milhares de células).

O cálcio é imaged in vivo usando sensores familiares GCaMP⁷ (ou pericam⁸⁾geneticamente codificados, que são variantes de proteína fluorescente verde mutada circularmente (GFP) fundida à calmodulina de proteína de ligação ao cálcio e sua seqüência alvo, fragmento M13 da cadeia de luz de miosina kinase^7,9. GCaMPs têm excelentes índices de sinal para ruído na faixa de concentrações nanomolar Ca^{2 +} e uma alta seção transversal de 2 fótons, o que os torna uma escolha ideal para in vivo trabalho^10,11. O aspecto desafiador do uso de sensores recombinantes é a sua entrega nas células. A expressão heterologous exige usar um vetor viral e um culturing ex vivo multi-hour, que levante freqüentemente interesses a respeito da desdiferenciação ou da deterioração potencial de funções da pilha. Embora os modelos de mouse pré-projetados para expressar gcamp resolver este problema, eles adicionam novos desafios, aumentando o prazo de entrega substancialmente e limitando o trabalho a um modelo não-humano. A sensibilidade muito alta às mudanças do pH intracelular é um outro lado adverso dos sensores proteína-baseados^12,que seja, entretanto, menos de um problema para sensoriamento de sinais oscilatórios, tais como Ca²⁺.

A vantagem de corantes trappable (tais como fluo4 fluorescente verde) é que podem ser carregados no tecido recentemente isolado dentro ao redor de uma hora. Previsivelmente, corantes trappable têm menores relações sinal-ruído e (muito) menor fotostability do que os seus homólogos recombinantes. Não podemos confirmar¹³ os relatos de toxicidade dos corantes trapistas¹⁴, no entanto, a sobrecarga de corante é um problema frequente.

Os sensores Vermelhos Recombinant Ca²⁺ baseados na permutação circular têm evoluído rapidamente desde 2011^15,e os desenvolvimentos mais recentes apresentam uma forte concorrência aos GCaMPs¹⁶ para imagens de tecido, dada a maior profundidade de penetração da luz vermelha. As tinturas trappable vermelhas comercialmente disponíveis podem ser usadas confiantemente para a imagem latente da único-pilha mas, no nível do tecido, não podem competir bem com os análogos verdes.

Há aparentemente muito pouca escolha de tecnologia de imagem para experimentos em tecidos onde a luz fora de foco se torna um problema crítico. O sistema confocal fornece resolução de célula única aceitável pelo cancelamento da luz fora de foco com qualquer objetivo sobre o NA acima de 0,3 (para o caso de GCaMP6) ou 0,8 (corantes trapaceiros). Em um sentido técnico, um microscópio confocal convencional pode ser usado para imagens simultâneas de [Ca²⁺]_cyt de centenas (GCaMP) ou dezenas de ilhotas (tinuoso trapaceiro trapaceiro). A única alternativa realista ao modo confocal em caso de expressão 3D do sensor no tecido é talvez microscopia de folha de luz.

As coisas são ligeiramente diferentes para o caso quando o sensor é expresso na camada periférica de pilhas dentro do tecido da ilhota. Para sensores recombinantes brilhantes que tenham um padrão de expressão intracelular vívido, o uso de um modo de imagem de campo largo com um objetivo de baixo NA pode fornecer qualidade suficiente e recompensar o pesquisador com um aumento substancial na área de campo de visão e, portanto, Transferência. Um sistema de campo largo fornece uma resolução espacial mais pobre, uma vez que a luz fora de foco não é cancelada; Portanto, o tecido de imagem com objetivos de alta NA (baixa profundidade de campo) é menos informativo, já que o sinal unicelular está muito contaminado pelas células vizinhas. A contaminação é muito menor para objetivos de baixo NA (alta profundidade de campo).

Há tarefas, no entanto, para as quais a alta taxa de taxa de taxa de taxa de taxa de taxa de taxa de taxa de taxa de taxa de mortalidade e/ou amostragem se torna uma vantagem crítica. as células α e δ apresentam heterogeneidade substancial, o que cria uma demanda por tamanhos amostrais elevados para revelar a contribuição das subpopulações. A imagem latente wide-field é rápida e mais sensível, com um sistema de grande escala industrial de grande imagem de imagem de centenas (GCaMP) ou dezenas (Fluo4) de ilhotas na mesma relação sinal-ruído que as experiências confocal em dez ou uma única ilhota, respectivamente. Esta diferença de perceção torna o sistema de campo largo vantajoso para a imagem de imagem populational com uma resolução unicelular, que pode ser especialmente crítica para pequenas subpopulações, como a célula-δ. Da mesma forma, as tentativas de reconstruir a atividade elétrica de Ca^{2 +} spiking¹⁷ se beneficiaria matução da maior taxa de amostragem fornecida por um modo de imagem de campo largo. Ao mesmo tempo, vários problemas de “nicho”, como a atividade das células α pancreáticas após a estimulação da subpopulação β-célula dominante, requerem o uso de um sistema confocal. Um fator que influencia a decisão em relação ao modo confocal é a presença de sinal contaminante substancial da subpopulação β-célula.

Embora o uso de coloração de anticorpos específicos para o hormônio para verificar a identidade das células após os experimentos de imagem ainda seja uma opção, subpopulações celulares menores podem ser identificadas usando compostos de marcadores funcionais, como adrenalina e grelina que foram mostrados para estimular seletivamente a dinâmica Ca²⁺ em α-¹⁸ e células-δ^19,20, respectivamente.

A análise dos dados de imagem de lapso de tempo visa fornecer informações além da farmacologia trivial, como heterogeneidade populacional, correlação e interação de diferentes sinais. Convencionalmente, os dados de imagem são analisados como intensidade versus tempo e normalizados para a fluorescência inicial (F/F_0). A correção de base é frequentemente necessária, devido ao branqueamento do sinal de floroffora ou contaminação por alterações na autofluorescência ou pH (normalmente induzidas por níveis milimolar de glicose^12). Os dados ca²⁺ podem ser analisados de muitas maneiras diferentes, mas três tendências principais são medir mudanças na frequência de pico, na fração do platô ou na área a curva, computadas versus tempo. Nós encontramos a última aproximação vantajosa, especial na aplicação aos dados confocal pesadamente undersampled. A vantagem da métrica pAUC é a sua sensibilidade para ambas as alterações na frequência e amplitude do sinal, enquanto a computação da frequência requer um número substancial de oscilações²¹, o que é difícil de alcançar usando imagens convencionais. O fator limitante da análise pAUC é sua alta sensibilidade às mudanças de base.

Protocol

Todos os métodos descritos aqui foram desenvolvidos de acordo com a Lei de Animais do Reino Unido (Procedimentos Científicos) (1986) e as diretrizes éticas da Universidade de Oxford. 1. Isolar ilhotas pancreáticas de camundongos Prepare o meio cultural e a solução de isolamento. Compõem o meio cultural: RMPI1640 (ver Tabela de Materiais),complementada com 10% do soro de vitela fetal, 100 unidades/mL penicilina, 100 μg/mL estreptomicina. Dispense o mei…

Representative Results

Ilhotas carregar bastante bem com os corantes trappable(Figura 1A), a menos que a composição lipídica da membrana tenha sido afetada (por exemplo, pela exposição crônica a ácidos graxos). O vetor humano do tipo 5 do adenovirus (Ad5) igualmente alveja todas as pilhas da ilhota(figura 1B). Problemas podem surgir quando mais de um sensor recombinante está sendo expresso na mesma célula. Além disso, as ilhotas são tipicam…

Discussion

Há três etapas no protocolo que são críticas para o sucesso global. A injeção bem sucedida da enzima Liberase no duto biliar determina não apenas o sucesso quantitativo do procedimento de isolamento, mas também afeta a qualidade das ilhotas isoladas. Pancreata não inflado pode resultar em falta de algumas respostas metabólicas importantes nas ilhotas isoladas. Em segundo lugar, o carregamento do tintendência/a expressão do sensor define a relação sinal/ruído da gravação de lapso de tempo. Os sinais estã…

Materials

40x/1.3 objective
Axiovert 200 microscope
emission
Excitation
Fetal bovine serum	Sigma-Аldrich	F7524-500ML
Fluo4	ThermoFisher (Life Technologies)	F14201
GCaMP6f, in (human type 5) adenoviral vector	Vector Biolabs	1910
Hanks' solution	ThermoFisher (GibCo, Life Technologies)
Liberase	Sigma-Аldrich	5401020001
penicillin/streptomycin	ThermoFisher (GibCo, Life Technologies)	15140122
RPMI medium	ThermoFisher (GibCo, Life Technologies)	61870044
Zeiss LSM510-META confocal system	Carl Zeiss