초파리 멜라노가스터에서 내분비 장애를 테스트하는 방법
Summary
내분비 파괴 물질 (EDC)은 유기체와 자연 환경에 심각한 문제를 나타냅니다. 드로소필라 멜라노가스터는 생체 내에서 EDC 효과를 연구하는 이상적인 모델을 나타낸다. 여기에서, 우리는 Drosophila에 있는 내분비 중단을 조사하는 방법을 제시합니다, fecundity에 EDC 효력을, 비옥, 발달 타이밍 및 비행의 수명을 해결하.
Abstract
최근 몇 년 동안 모든 유기체와 환경이 내분비 장애 화학 물질 (EDC)으로 알려진 호르몬과 같은 화학 물질에 노출된다는 증거가 증가하고 있습니다. 이러한 화학 물질 내 분 비 시스템의 정상적인 균형을 변경 하 고 부작용으로 이어질 수 있습니다., 인간 인구에 호르몬 장애의 증가 뿐만 아니라 또는 방해 성장 및 야생 동물 종에서 감소 된 재생산. 일부 EDC의 경우, 문서화 된 건강 효과 및 그들의 사용에 제한이 있다. 그러나, 그들 대부분에 대 한, 여전히 이 의미에서 과학적 증거가 있다. 전체 유기체에서 화학 물질의 잠재적 인 내분비 효과를 확인하기 위해, 우리는 적절한 모델 시스템뿐만 아니라 과일 파리, Drosophila 멜라 노가스터에서테스트해야합니다. 여기에서 우리는 초파리에 있는 내분비 중단을 공부하기 위하여 생체 내비염에서 상세한 보고, fecundity/불임에 EDC 효력을, 발달 타이밍 및 비행의 수명을 해결하. 지난 몇 년 동안, 우리는 17-α-에티닐에스트라디올 (EE2), 비스페놀 A (BPA) 및 비스페놀 AF (BPA F)에 노출의 효력을 조사하기 위하여 이 Drosophila 생활 특선 특성을 이용했습니다. 전부, 이 asays는 모든 Drosophila 생활 단계를 커버하고 가능한 모든 호르몬 중재프로세스에 있는 내분비 중단을 평가하는 가능하게 했습니다. fecundity/fertility 및 발달 타이밍 측정은 각각 비행 생식 성과 및 발달 단계에 EDC 충격을 측정하는 데 유용했습니다. 마지막으로, 수명 분석성인에 만성 EDC 노출을 관련시키고 그들의 생존을 측정했습니다. 그러나, 이러한 생활 특성또한 신중 하 게 제어 했다 몇 가지 실험 요인에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 그래서, 이 작품에서는, 우리는 이 검소의 적당한 결과를 위해 우리가 최적화한 일련의 절차를 건의합니다. 이 방법은 과학자가 어떤 EDC든지를 위한 내분비 중단을 설치하거나 Drosophila에 있는 다른 EDC의 혼합물을 위해, 효력에 책임 있는 내분비 기계장치를 확인하기 위하여, 추가 에세이가 필요할 수 있었습니다.
Introduction
인간의 활동은 유기체와 자연 생태계에 대한 심각한 문제를 나타내는 화학 물질의 엄청난 양의 환경에 방출되고있다1. 이러한 오염 물질 중 약 1,000 개의 다른 화학 물질이 내분비 시스템의 정상적인 균형을 바꿀 수 있다고 추정됩니다. 이 속성에 따르면, 그들은 내분비 파괴 화학 물질 (EDC)로 분류됩니다. 구체적으로, 내분비 학회에 의한 최근의 정의에 기초하여, EDC는 “호르몬 작용의 어떤 양상든지 방해할수 있는 외인성 화학물질, 또는 화학물질의 혼합물”2 . 지난 3 년 동안, EDC가 동물과 식물의 번식과 발달에영향을 미칠 수 있다는 과학적 증거가 증가하고있다 3,4,5,6,7, 8. 또한, EDC 노출은 암, 비만, 당뇨병, 갑상선 질환 및 행동 장애를 포함하는 일부 인간 질병의 증가 보급과 관련이있다9,10,11.
EDC의 일반적인 메커니즘
그들의 분자 속성 때문에, EDC는 호르몬 또는 호르몬 전구체 처럼 행동3,4,5,6, 7,8,9, 10,11,12. 이 의미에서, 그들은 호르몬의 수용 체에 바인딩 하 고 호르몬 활동을 모방 하 여 또는 내 인 성 호르몬 바인딩을 차단 하 여 내 분 비 시스템을 중단 수 있습니다. 첫 번째 경우에, 수용 체에 바인딩 후, 그들은 그것의 자연 호르몬 으로 그것을 활성화할 수 있습니다. 다른 경우에는 EDC를 수용체에 결합하면 자연 호르몬의 결합을 방지하므로 수용체가 차단되고 자연 호르몬이있는 경우에도 더 이상활성화 될 수 없습니다 3. 결과적으로, EDC는 항상성의 유지 보수, 재생산, 발달 및 / 또는 행동의 유지를 담당하는 내인성 호르몬의 합성, 분비, 수송, 신진 대사 또는 말초 작용과 같은 여러 과정에 영향을 미칠 수 있습니다. 유기체. 수용체 결합은 EDC에 대해 지금까지 설명된 유일한 작용 방법이 아니다. 그것은 지금 그(것)들이 또한 효소 통로에 있는 coactivators 또는 코어프레서를 모집하거나 유전자 발현을 통제하는 후성 유전학 마커를 수정해서 작동할 수 있다는 것을 명백합니다10,11,12,13 ,14, 현재 세대뿐만 아니라 올 세대의 건강에 대한 뿐만 아니라 결과와함께 8.
초파리 호르몬
선택된 EDC의 잠재적인 효력은 야생 동물 종및 내분비 기계장치가 합리적으로 잘 알려진 몇몇 모형 체계에서 넓게 공부되었습니다. 무척추 동물의 경우, 성장, 개발 및 번식에 영향을 미치는 내분비 시스템은 생물학적 연구 분야에서 광범위하게 사용, 경제적 중요성 및 여러 가지 이유로 곤충을 광범위하게 특징으로합니다. 마지막으로 해충 곤충의 호르몬 시스템을 구체적으로 방해 할 수있는 살충제의 개발.
특히, 곤충 중에서 과일 플라이 D. 멜라노가스터는 EDC의 잠재적 내분비 효과를 평가하는 매우 강력한 모델 시스템으로 입증되었습니다. D. 멜라노가스터에서,뿐만 아니라 척추 동물에서, 호르몬은 전체 수명 주기 에 걸쳐 중요 한 역할을. 이 유기체에는 스테로이드 호르몬 20-하이드록시엑디손(20E)15,16,세스키트르페노이드 청소년 호르몬(JH)17,및 뉴로펩타이드 및 펩티드/단백질을 포함하는 3가지 주요 호르몬 시스템이 있다. 호르몬18. 이 세 번째 그룹은 장수, 항상성, 신진 대사, 재생, 기억 및 운동 조절과 같은 다양한 생리 적 및 행동 과정에 명확하게 관여하는 여러 펩티드로 구성되어 있습니다. 20E는 에스트라디올과 같은 콜레스테롤 유래 스테로이드 호르몬에 상동성이며 JH는 레티노산과 몇 가지 유사점을 공유합니다. 둘 다 초파리19,20에서더 잘 알려진 호르몬이다. 그들의 균형은 몰팅과 변태를 조정하는 데 매우 중요하며, 재생, 수명 및 행동21과같은 여러 개발 후 프로세스를 제어하여 내분비 검사를 위한 다양한 가능성을 제공합니다. 초파리에 있는 중단. 또한, ecdysteroid 호르몬과 JHs는 곤충에 있는 발달과 생식 내분비 중재프로세스를 방해하기 위하여 개발된 소위 제 3 세대 살충제의 주요 표적입니다. 이러한 화학물질의 작용의 작용의 작용의 작용 또는 길항제 모드는 잘 알려져 있으며, 따라서 곤충의 성장, 번식 및 발달에 대한 잠재적 EDC의 영향을 평가하기 위한 기준으로서 작용할 수 있다22. 예를 들어, 메토프레네는 모기 및 기타 수생곤충(23,24)을조절하는 데 널리 사용되어 왔으며, JH 작용제로서 작용하고 20E-유도 유전자 전사 및 변태를 억압한다.
호르몬 이외에, 핵 수용체 (NR) 초등파의 슈퍼 패밀리는 또한 잘 알려져 있다; 그것은 호르몬 의존적인 발달 통로 통제에서 관련시킨 18의 진화적으로 보존한 전사 요인, 뿐만 아니라 재생산 및 생리학25로이루어져 있습니다. 이 호르몬 NR은 신경전달에 관여하는 사람들을 포함하여 모든 6개의 NR superfamily 특수형에 속합니다 26, 레티노산 NR을 위한 2개, 및 척추동물에서, EDC27의 1차 표적의 한을 나타내는 스테로이드 NR을 위한 그.
EDC 를 연구하기위한 모델 시스템으로 초파리
현재 분자 특성에 기초하여 전 세계의 여러 환경 기관은 내분비 계통을 다른 인공 화학 물질에 방해할 수 있는 잠재력을 기인하고 있습니다. EDC가 환경과 유기체에 대한 세계적이고 유비쿼터스적인 문제라는 점을 감안할 때, 이 분야의 연구의 전반적인 목표는 질병 부담을 줄이고 살아있는 유기체를 부작용으로부터 보호하는 것입니다. 화학 물질의 잠재적인 내 분 비 효과 대 한 이해를 심화 하기 위해, 생체 내에서 그것을 테스트 하는 데 필요한. 이를 위해, D. 멜라노가스터는 유효한 모델 시스템을 나타낸다. 현재까지, 과일 파리는 여러 환경 EDC의 효과를 평가하기 위해 생체 내 모델로 광범위하게 사용되어 왔다; 디부틸 프탈레이트(DBP)28,비스페놀 A(BPA), 4-논일페놀(4-NP), 4-테르트-옥틸페놀(4-tert-OP)29,메틸파라벤(MP)30,에틸파라벤(EP) 30, 에틸파라벤(EP)31, 32,비스-(2-에틸헥실) 프탈레이트(DEHP)33,및 17-α-에티닐에스트라디올(EE2)34,척추동물 모델에서와 같이 대사 및 내분비 기능에 영향을 미친다. 몇 가지 이유가 연구의이 분야에서 모델로 그것의 사용을 주도 했다. 내분비 시스템에 대한 뛰어난 지식을 넘어, 더 많은 장점은 짧은 수명 주기, 저렴한 비용, 쉽게 관리 게놈, 연구의 오랜 역사, 여러 기술적 가능성 (FlyBase 웹 사이트, http://flybase.org/ 참조)를 포함한다. D. melanogaster는 또한 환경 요인에 대한 세대 간 효과 및 인구 반응을 쉽게 연구하기위한 강력한 모델을 제공8 높은 동물의 생체 내 연구와 관련된 윤리적 문제를 방지 할 수 있습니다. 또한, 과일 파리 예측 또는 인간의 건강에 대 한 이러한 화학 물질의 잠재적인 효과 제안에 도움이 Drosophila EDC 검사에 대 한 가능 할 수 있는 인간과 유전자 보존의 높은 학위를 공유. 인간의 건강 효과에 대한 이해를 확대하는 것 외에도, Drosophila는 생물 다양성 손실 및 환경 저하와 같은 환경에 대한 EDC 노출의 위험을 평가하는 데 도움이 될 수 있습니다. 마지막으로, 과일 파리는 실험실에서 사용되는 추가 이점을 제공하며, 이 곳에서 잠재적으로 개발, 번식 및 수명에 영향을 미치는 요인이 테스트할 물질의 변형을 특성화하기 위해 통제할 수 있습니다.
이 점을 염두에 두고, 우리는 여성/불 임, 발달 타이밍 및 성인 수명과 같은 일부 Drosophila 호르몬 특성에 EDC 효과를 결정하기 위한 간단하고 강력한 피트니스 분석에 최적화했습니다. 이러한 어세이는 일부 EDC23,24,25,26,27에널리 사용되어 왔다. 특히, 우리는 합성 에스트로겐 EE2(34) 및 BPA 및 비스페놀 AF(BPA F)에 대한 노출의 효과를 평가하기 위해 다음 프로토콜을 사용하였다(미공개 데이터). 이러한 프로토콜은 D. melanogaster에있는 다중 EDC의 결합된 효력 뿐만 아니라, 한 번에 주어진 EDC의 효력을 조사하기 위하여 쉽게 수정될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
과일 플라이 D. 멜라노가스터는 DBP28,BPA, 4-NP, 4-tert-OP29,MP30,EP31 과 같은 환경 EDC의 잠재적 효과를 조사하기 위해 생체 내 모델 시스템으로 광범위하게 사용되고 있습니다. 32, DEHP33및 EE234. 몇 가지 이유가 연구의이 분야에서 모델로 그것의 사용을 주도 했다. ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 기술 지원을 위해 오르솔리나 페티요에게 감사드립니다. 저자는 마리아로사리아 아레타 박사(CNR)에게 서지 지원에 감사드립니다. 저자들은 구스타보 다미아노 미타 박사가 EDC 세계에 소개해 준 것에 대해 감사를 표합니다. 저자들은 라이카 마이크로시스템스와 파스칼레 로마노의 도움에 감사를 표한다. 이 연구는 프로젝트 PON03PE_00110_1에 의해 지원되었다. “Sviluppo di nanotecnologie 오리엔타테 알라 리제네지오네 e 리코스트루지오네 티수탈, 임플란트톨로지아 e 감각학 오돈토이아트리아/오큘리스티카” 아크로니모 “소리소”; 커밋텐트: PO FESR 2014-2020 캄파니아; 프로젝트 PO FESR 캄파니아 2007-2013 “일 릴라시오 제어라토 디 몰레콜 바이오 -ATTIVE 나노 테놀로지 당 나노 테놀로지”.
Materials
| 17α-Ethinylestradiol | Sigma | E4876-1G | |
| Agar for Drosophila medium | BIOSIGMA | 789148 | |
| Bisphenol A | Sigma | 239658-50G | |
| Bisphenol AF | Sigma | 90477-100MG | |
| Cornmeal | CA' BIANCA | ||
| Diethyl ether | Sigma | ||
| Drosophila Vials | BIOSIGMA | 789008 | 25×95 mm |
| Drosophila Vials | BIOSIGMA | 789009 | 29×95 mm |
| Drosophila Vials | Kaltek | 187 | 22X63 |
| Embryo collection cage | Crafts | Plexiglass cylinder (12,5 x7 cm) with an open end and the other end closed by a rectangular base in which a slot allows the insertion of special trays for laying | |
| Ethanol | FLUKA | 2860 | |
| Etherizer | Crafts | cylindrical glass container with a cotton plug | |
| Glass Bottle | 250mL Bottles | ||
| Glass Vials | Microtech | ST 10024 | FLAT BOTTOM TUBE 100X24 |
| Hand blender Pimmy | Ariete | food processor | |
| Instant Success yeast | ESKA | Powdered yeast | |
| Laying tray | Crafts | plexiglass trays (11 x 2,6 cm) in wich to pour medium for laying | |
| Methyl4-hydroxybenzoate | SIGMA | H5501 | |
| Petri Dish | Falcon | 351016 | 60×5 |
| Red dye no. 40 | SIGMA | 16035 | |
| Stereomicroscope with LED lights | Leica | S4E | |
| Sucrose | HIMEDIA | MB025 | |
| Tomato sauce | Cirio |
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