Metodi per testare la disgregazione endocrina nella Drosophila melanogaster
Summary
Le sostanze chimiche interferenti endocrine (EDC) rappresentano un grave problema per gli organismi e per gli ambienti naturali. La Drosophila melanogaster rappresenta un modello ideale per studiare gli effetti della CED in vivo. Qui, presentiamo metodi per studiare la perturbazione endocrina nella Drosophila, affrontando gli effetti della CED sulla fecondità, la fertilità, i tempi di sviluppo e la durata della vita della mosca.
Abstract
Negli ultimi anni ci sono state sempre più prove che tutti gli organismi e l’ambiente sono esposti a sostanze chimiche ormonali-come, noto come sostanze chimiche interferenti endocrine (EDC). Queste sostanze chimiche possono alterare il normale equilibrio dei sistemi endocrini e portare a effetti negativi, nonché un numero crescente di disturbi ormonali nella popolazione umana o una crescita disturbata e una minore riproduzione nelle specie selvatiche. Per alcuni EDC, ci sono documentati effetti sulla salute e restrizioni sul loro uso. Tuttavia, per la maggior parte di loro, non c’è ancora alcuna prova scientifica in questo senso. Al fine di verificare potenziali effetti endocrini di una sostanza chimica nel tutto l’organismo, abbiamo bisogno di testarlo in sistemi modello appropriati, così come nel filo della frutta, Drosophila melanogaster. Qui riportiamo protocolli dettagliati in vivo per studiare la perturbazione endocrina nella Drosophila, affrontando gli effetti della CED sulla fecondità/fertilità, sui tempi di sviluppo e sulla durata della vita della mosca. Negli ultimi anni, abbiamo usato questi tratti della vita della Drosophila per studiare gli effetti dell’esposizione al 17-e-ethinylestradiol (EE2), al bisfenolo A (BPA) e al bisfenolo AF (BPA F). Complessivamente, questi saggi hanno coperto tutte le fasi della vita della Drosophila e hanno permesso di valutare la perturbazione endocrina in tutti i processi mediati dall’ormone. I saggi di fedia/fertilità e tempistica dello sviluppo sono stati utili per misurare l’impatto della CED sulle prestazioni riproduttive delle mosche e sugli stadi dello sviluppo, rispettivamente. Infine, il saggio della durata della vita ha coinvolto esposizioni croniche di EDC agli adulti e ha misurato la loro sopravvivenza. Tuttavia, questi tratti di vita possono anche essere influenzati da diversi fattori sperimentali che dovevano essere attentamente controllati. Quindi, in questo lavoro, suggeriamo una serie di procedure che abbiamo ottimizzato per il giusto risultato di questi saggi. Questi metodi consentono agli scienziati di stabilire interruzioni endocrine per qualsiasi EDC o per una miscela di diversi EDC in Drosophila, anche se per identificare il meccanismo endocrino responsabile dell’effetto, potrebbero essere necessari ulteriori saggi.
Introduction
Le attività umane hanno rilasciato nell’ambiente una massiccia quantità di sostanze chimiche, che rappresentano un grave problema per gli organismi e per gli ecosistemi naturali1. Di questi inquinanti, si stima che circa 1.000 sostanze chimiche diverse possano alterare il normale equilibrio dei sistemi endocrini; in base a questa proprietà, sono classificati come sostanze chimiche interferenti endocrine (EDC). In particolare, sulla base di una recente definizione della Società Endocrina, i CED sono “una sostanza chimica esogena, o miscela di sostanze chimiche, che può interferire con qualsiasi aspetto dell’azione ormonale”2. Negli ultimi tre decenni, ci sono state sempre più prove scientifiche che i CED possono influenzare la riproduzione e lo sviluppo di animali e piante3,4,5,6,7, 8. Ulteriormente, l’esposizione alla CED è stata correlata alla crescente prevalenza di alcune malattie umane, tra cui il cancro, l’obesità, il diabete, le malattie della tiroide e i disturbi comportamentali9,10,11.
Meccanismi generali di EdC
A causa delle loro proprietà molecolari, gli EDC si comportano come ormoni o precursori ormonali3,4,5,6,7,8,9, 10,11,12. In questo senso, possono legarsi al recettore di un ormone e interrompere i sistemi endocrini sia imitando l’attività ormonale o bloccando l’attacco di ormoni endogeni. Nel primo caso, dopo il legame al recettore, possono attivarlo come farebbe il suo ormone naturale. Nell’altro caso, il legame della CED al recettore impedisce il legame del suo ormone naturale, quindi il recettore è bloccato e non può più essere attivato, anche in presenza del suo ormone naturale3. Di conseguenza, gli EDC possono influenzare diversi processi, come la sintesi, la secrezione, il trasporto, il metabolismo o l’azione periferica di ormoni endogeni che sono responsabili del mantenimento dell’omeostasi, della riproduzione, dello sviluppo e/o del comportamento l’organismo. L’associazione del recettore non è l’unico modo di agire descritto finora per gli EDC. Ora è chiaro che possono anche agire reclutando coattivatori o corepressor in percorsi enzimatici o modificando marcatori epigenetici che deregolamentano l’espressione genica10,11,12,13 ,14, con conseguenze non solo per la generazione attuale ma anche per la salute delle generazioni a venire8.
Ormoni della drosofilia
I potenziali effetti di EDC selezionati sono stati studiati ampiamente, sia nelle specie selvatiche che in diversi sistemi modello in cui i meccanismi endocrini sono ragionevolmente ben noti. Per gli invertebrati, i sistemi endocrini che influenzano la crescita, lo sviluppo e la riproduzione sono stati ampiamente caratterizzati negli insetti per diversi motivi, coinvolgendo il loro ampio uso nel campo della ricerca biologica, la loro importanza economica e infine lo sviluppo di insetticidi in grado di interferire specificamente con il sistema ormonale degli insetti parassiti.
In particolare, tra gli insetti, il viafrutto della frutta D. melanogaster si è dimostrato un sistema modello molto potente per valutare i potenziali effetti endocrini degli EDC. In D. melanogaster, così come nei vertebrati, gli ormoni svolgono un ruolo importante durante l’intero ciclo di vita. In questo organismo, ci sono tre principali sistemi ormonali, che coinvolgono l’ormone steroide 20-idrossiecdysone (20E)15,16, l’ormone giovanile sesprorpenoide (JH)17, e i neuropeptidi e peptidi/ proteine ormoni18. Questo terzo gruppo è costituito da diversi peptidi scoperti più di recente ma chiaramente coinvolti in una grande varietà di processi fisiologici e comportamentali, come longevità, omeostasi, metabolismo, riproduzione, memoria e controllo locomotore. 20E è omologa agli ormoni steroidei derivati dal colesterolo come estradiolo, mentre JH condivide alcune somiglianze con acido retinoico; entrambi sono gli ormoni più noti in Drosophila19,20. Il loro equilibrio è fondamentale nel coordinare la fiscie e la metamorfosi, nonché nel controllo di diversi processi post-sviluppo, come la riproduzione, la durata della vita e il comportamento21,offrendo così diverse possibilità di testare l’endocrino perturbazione nella Drosophila. Inoltre, gli ormoni ecriosteroidi e JH sono i principali bersagli dei cosiddetti insetticidi di terza generazione, sviluppati per interferire con i processi mediati endocrini dello sviluppo e riproduttivi negli insetti. La modalità d’azione agonista o antagonista di queste sostanze chimiche è ben nota, e quindi possono servire come standard di riferimento per valutare gli effetti dei potenziali EDC sulla crescita, la riproduzione e lo sviluppo degli insetti22. Ad esempio, il methoprene, che è stato ampiamente utilizzato nel controllo di zanzare e altri insetti acquatici23,24, funziona come un agonista JH e reprime la trascrizione genica e la metamorfosi indotta da 20E.
Oltre agli ormoni, la superfamiglia del recettore nucleare (NR) nella Drosophila è anche ben nota; è costituito da 18 fattori di trascrizione evolutivamente conservati coinvolti nel controllo dei percorsi evolutivi dipendenti dall’ormone, così come la riproduzione e la fisiologia25. Questi NR ormone appartengono a tutti i sei sottotipi di superfamiglia NR, compresi quelli coinvolti nella neurotrasmissione26, due per gli acido retinoico NRs, e quelli per gli steroidi NRs che, nei vertebrati, rappresentano uno degli obiettivi primari di EDC27.
La Drosophila come sistema modello per studiare gli EDC
Attualmente, sulla base di proprietà molecolari, diverse agenzie ambientali in tutto il mondo stanno attribuendo il potenziale di interferire con i sistemi endocrini a diverse sostanze chimiche artificiali. Dato che i CED sono un problema globale e onnipresente per l’ambiente e per gli organismi, l’obiettivo generale della ricerca in questo campo è ridurre il loro onere della malattia, nonché proteggere gli organismi viventi dai loro effetti negativi. Al fine di approfondire la comprensione circa i potenziali effetti endocrini di una sostanza chimica, è necessario testarlo in vivo. A tal fine, D. melanogaster rappresenta un sistema di modelli valido. Ad oggi, la mosca della frutta è stata ampiamente utilizzata come modello in vivo per valutare gli effetti di diversi EDC ambientali; è stato riferito che l’esposizione a diversi EDC, come lo ftalato diaill (DBP)28, il bisfenolo A (BPA), 4-nonylphenol (4-NP), 4-tert-octylphenol (4-tert-OP)29, metilparaben (MP)30, ethylparaben (EP)31 32, bis-(2-ethylhexyl) ftalato (DEHP)33, e 17-ethinylestradiol (EE2)34, influenza il metabolismo e le funzioni endocrine come nei modelli vertebrati. Diverse ragioni hanno portato al suo utilizzo come modello in questo campo di ricerca. Al di là di un’ottima conoscenza dei suoi sistemi endocrini, ulteriori vantaggi includono il suo breve ciclo di vita, il basso costo, il genoma facilmente manipolabile, una lunga storia di ricerca e diverse possibilità tecniche (vedi il sito web FlyBase, http://flybase.org/). D. melanogaster fornisce anche un potente modello per studiare facilmente gli effetti transgenerazionali e le risposte della popolazione ai fattori ambientali8 ed evita le questioni etiche rilevanti per gli studi in vivo su animali superiori. Inoltre, la mosca della frutta condivide un alto grado di conservazione genica con gli esseri umani che potrebbe consentire ai saggi della Dnosophila EDC di aiutare a prevedere o suggerire potenziali effetti di queste sostanze chimiche per la salute umana. Oltre ad ampliare la comprensione degli effetti sulla salute umana, la Drosophila può contribuire a valutare i rischi di esposizione della CED all’ambiente, come la perdita di biodiversità e il degrado ambientale. Infine, la mosca della frutta offre il vantaggio aggiuntivo di essere utilizzata nei laboratori, dove i fattori che potenzialmente influenzano il suo sviluppo, la riproduzione e la durata della vita possono essere tenuti sotto controllo al fine di attribuire qualsiasi variazione alla sostanza da testare.
Con questo in mente, abbiamo ottimizzato semplici e robusti saggi di fitness per determinare gli effetti EDC su alcuni tratti ormonali della Drosophila, come la fecondità/fertilità, i tempi di sviluppo e la durata della vita adulta. Questi saggi sono stati ampiamente utilizzati per alcuni EDC23,24,25,26,27. In particolare, abbiamo utilizzato i seguenti protocolli per valutare gli effetti dell’esposizione all’estrogeno sintetico EE234 e al BPA e al bisfenolo AF (BPA F) (dati inediti). Questi protocolli possono essere facilmente modificati per studiare gli effetti di un dato EDC alla volta, così come gli effetti combinati di più EDC in D. melanogaster.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il fly d. melanogaster è stato ampiamente impiegato come sistema modello in vivo per studiare i potenziali effetti di EDC ambientali come DBP28, BPA, 4-NP, 4-tert-OP29, MP30, EP31, 32, DEHP33ed EE234. Diverse ragioni hanno portato il suo utilizzo come modello in questo campo di ricerca. A parte i suoi indiscussi vantaggi come sistema …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Orsolina Petillo per il supporto tecnico. Gli autori ringraziano la Dott.ssa Mariarosaria Aletta (CNR) per il supporto bibliografico. Gli autori ringraziano il Dr. Gustavo Damiano Mita per averli introdotti nel mondo EDC. Gli autori ringraziano Leica Microsystems e Pasquale Romano per il loro aiuto. Questa ricerca è stata supportata dal progetto PON03PE_00110_1. “Sviluppo di nanotecnologie Orientate alla Rigenerazione e Zzie Tissutale, Implantologia e Sensoristica in Odontoiatria/oculistica” acronimo “SORRISO”; Committente: PO FESR 2014-2020 CAMPANIA; Progetto PO FESR Campania 2007-2013 “NANO PERTECNOLOGIE O SOLAVOLTAO VOLTA E MOLECOLE BIO-ATTIVE NANO”.
Materials
| 17α-Ethinylestradiol | Sigma | E4876-1G | |
| Agar for Drosophila medium | BIOSIGMA | 789148 | |
| Bisphenol A | Sigma | 239658-50G | |
| Bisphenol AF | Sigma | 90477-100MG | |
| Cornmeal | CA' BIANCA | ||
| Diethyl ether | Sigma | ||
| Drosophila Vials | BIOSIGMA | 789008 | 25×95 mm |
| Drosophila Vials | BIOSIGMA | 789009 | 29×95 mm |
| Drosophila Vials | Kaltek | 187 | 22X63 |
| Embryo collection cage | Crafts | Plexiglass cylinder (12,5 x7 cm) with an open end and the other end closed by a rectangular base in which a slot allows the insertion of special trays for laying | |
| Ethanol | FLUKA | 2860 | |
| Etherizer | Crafts | cylindrical glass container with a cotton plug | |
| Glass Bottle | 250mL Bottles | ||
| Glass Vials | Microtech | ST 10024 | FLAT BOTTOM TUBE 100X24 |
| Hand blender Pimmy | Ariete | food processor | |
| Instant Success yeast | ESKA | Powdered yeast | |
| Laying tray | Crafts | plexiglass trays (11 x 2,6 cm) in wich to pour medium for laying | |
| Methyl4-hydroxybenzoate | SIGMA | H5501 | |
| Petri Dish | Falcon | 351016 | 60×5 |
| Red dye no. 40 | SIGMA | 16035 | |
| Stereomicroscope with LED lights | Leica | S4E | |
| Sucrose | HIMEDIA | MB025 | |
| Tomato sauce | Cirio |
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