Métodos para probar la interrupción endocrina en Drosophila melanogaster
Summary
Los productos químicos disruptores endocrinos (EDC) representan un problema grave para los organismos y para los entornos naturales. Drosophila melanogaster representa un modelo ideal para estudiar los efectos de la EDC in vivo. Aquí, presentamos métodos para investigar la interrupción endocrina en Drosophila, abordando los efectos de la EDC sobre la fecundidad, fertilidad, tiempo de desarrollo, y la vida útil de la mosca.
Abstract
En los últimos años ha habido creciente evidencia de que todos los organismos y el medio ambiente están expuestos a productos químicos similares a las hormonas, conocidos como productos químicos disruptores endocrinos (EDC). Estos productos químicos pueden alterar el equilibrio normal de los sistemas endocrinos y conducir a efectos adversos, así como un número creciente de trastornos hormonales en la población humana o crecimiento perturbado y reproducción reducida en las especies de vida silvestre. Para algunas EDCs, hay efectos documentados para la salud y restricciones en su uso. Sin embargo, para la mayoría de ellos, todavía no hay evidencia científica en este sentido. Con el fin de verificar los posibles efectos endocrinos de un producto químico en todo el organismo, necesitamos probarlo en sistemas modelo adecuados, así como en la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster. Aquí informamos protocolos in vivo detallados para estudiar la interrupción endocrina en Drosophila, abordando los efectos de la EDC en la fecundidad/fertilidad, tiempo de desarrollo y vida útil de la mosca. En los últimos años, utilizamos estos rasgos de vida Drosophila para investigar los efectos de la exposición a 17-o-etinilestradiol (EE2), bisfenol A (BPA), y bisfenol AF (BPA F). En conjunto, estos ensayos cubrieron todas las etapas de la vida de Drosophila y hicieron posible evaluar la interrupción endocrina en todos los procesos mediados por hormonas. Los ensayos de fecundidad/fertilidad y tiempo de desarrollo fueron útiles para medir el impacto de la EDC en el rendimiento reproductivo de la mosca y en las etapas del desarrollo, respectivamente. Por último, el ensayo de vida útil implicó exposiciones crónicas de la EDC a adultos y midió su supervivencia. Sin embargo, estos rasgos de vida también pueden ser influenciados por varios factores experimentales que tuvieron que ser cuidadosamente controlados. Por lo tanto, en este trabajo, sugerimos una serie de procedimientos que hemos optimizado para el resultado correcto de estos ensayos. Estos métodos permiten a los científicos establecer la interrupción endocrina para cualquier EDC o para una mezcla de diferentes EDC en Drosophila, aunque para identificar el mecanismo endocrino responsable del efecto, podrían ser necesarios ensayos adicionales.
Introduction
Las actividades humanas han estado liberando al medio ambiente una enorme cantidad de productos químicos, que representan un grave problema para los organismos y para los ecosistemas naturales1. De estos contaminantes, se estima que unos 1.000 productos químicos diferentes pueden alterar el equilibrio normal de los sistemas endocrinos; según esta propiedad, se clasifican como sustancias químicas disruptoras endocrinas (EDC). Específicamente, sobre la base de una definición reciente de la Sociedad Endocrina, las EDC son “un químico exógeno, o mezcla de productos químicos, que puede interferir con cualquier aspecto de la acción hormonal”2. En las últimas tres décadas, ha habido cada vez más evidencia científica de que las EDC pueden afectar a la reproducción y desarrollo de animales y plantas3,4,5,6,7, 8. Además, la exposición a la EDC se ha relacionado con la creciente prevalencia de algunas enfermedades humanas, incluyendo cáncer, obesidad, diabetes, enfermedades tiroideas, y trastornos del comportamiento9,10,11.
Mecanismos generales de la EDC
Debido a sus propiedades moleculares, los EDC se comportan como hormonas o precursores hormonales3,4,5,6,7,8,9, 10,11,12. En este sentido, pueden unirse al receptor de una hormona y interrumpir los sistemas endocrinos ya sea imitando la actividad hormonal o bloqueando la unión de hormonas endógenas. En el primer caso, después de la unión al receptor, pueden activarlo como su hormona natural haría. En el otro caso, la unión de la EDC al receptor impide la unión de su hormona natural, por lo que el receptor está bloqueado y ya no se puede activar, incluso en presencia de su hormona natural3. Como consecuencia, los EDC pueden afectar a varios procesos, como la síntesis, secreción, transporte, metabolismo o acción periférica de hormonas endógenas que son responsables del mantenimiento de la homeostasis, reproducción, desarrollo y/o comportamiento de el organismo. La unión del receptor no es la única forma de acción descrita hasta ahora para las EDC. Ahora está claro que también pueden actuar reclutando coactivadores o corepresores en vías enzimáticas o modificando marcadores epigenéticos que desreguladoran la expresión génica10,11,12,13 ,14, con consecuencias no sólo para la generación actual, sino también para la salud de las generaciones venideros8.
Hormonas drosofílicas
Los efectos potenciales de las EDC seleccionadas se han estudiado ampliamente, tanto en especies de vida silvestre como en varios sistemas de modelos en los que los mecanismos endocrinos son razonablemente bien conocidos. En el caso de los invertebrados, los sistemas endocrinos que influyen en el crecimiento, el desarrollo y la reproducción se han caracterizado ampliamente en insectos por varias razones, lo que implica su uso extensivo en el campo de la investigación biológica, su importancia económica y finalmente el desarrollo de insecticidas capaces de interferir específicamente con el sistema hormonal de los insectos de plagas.
En particular, entre los insectos, la mosca de la fruta D. melanogaster ha demostrado ser un sistema modelo muy potente para evaluar los posibles efectos endocrinos de las EDC. En D. melanogaster, así como en los vertebrados, las hormonas juegan un papel importante a lo largo de todo el ciclo de vida. En este organismo, hay tres sistemas hormonales principales, que involucran la hormona esteroide 20-hidroxiediseano (20E)15,16, la hormona juvenil sesquiterpenoides (JH)17, y los neuropéptidos y péptidos /proteínas hormonas18. Este tercer grupo consta de varios péptidos descubiertos más recientemente pero claramente involucrados en una gran variedad de procesos fisiológicos y conductuales, tales como longevidad, homeostasis, metabolismo, reproducción, memoria, y control locomotor. 20E es homólogo a las hormonas esteroides derivadas del colesterol como el estradiol, mientras que la JH comparte algunas similitudes con el ácido retinoico; ambos son las hormonas más conocidas en Drosophila19,20. Su equilibrio es vital en la coordinación de la muda y la metamorfosis, así como en el control de varios procesos de postdesarrollo, como la reproducción, la vida útil y el comportamiento21,ofreciendo así diferentes posibilidades para probar endocrinos disrupción en Drosophila. Además, las hormonas ecdysteroid y los JH son los principales objetivos de los llamados insecticidas de tercera generación, desarrollados para interferir con los procesos mediados endocrinos en el desarrollo y la reproducción en los insectos. El modo agonista o antagonista de acción de estos productos químicos es bien conocido, y por lo tanto pueden servir como normas de referencia para evaluar los efectos de los posibles EDC en el crecimiento, reproducción y desarrollo de insectos22. Por ejemplo, el metopreno, que ha sido ampliamente utilizado en el control de mosquitos y otros insectos acuáticos23,24, funciona como un agonista JH y reprime la transcripción genética inducida por 20E y la metamorfosis.
Además de las hormonas, la superfamilia del receptor nuclear (NR) en Drosophila también es bien conocida; consiste en 18 factores de transcripción evolutivamente conservados involucrados en el control de las vías de desarrollo dependientes de las hormonas, así como la reproducción y fisiología25. Estas hormonas NR pertenecen a los seis subtipos de superfamilia NR, incluidos los involucrados en la neurotransmisión26,dos para los NR de ácido retinoico, y los de los NR esteroides que, en los vertebrados, representan uno de los objetivos principales de los EDC27.
Drosophila como sistema modelo para el estudio de las EDC
Actualmente, sobre la base de propiedades moleculares, varias agencias ambientales de todo el mundo están atribuyendo el potencial de interferir con los sistemas endocrinos a diferentes productos químicos artificiales. Dado que las EDC son un problema global y omnipresente para el medio ambiente y para los organismos, el objetivo general de la investigación en este campo es reducir su carga de morbilidad, así como proteger a los organismos vivos de sus efectos adversos. Con el fin de profundizar la comprensión sobre los posibles efectos endocrinos de un producto químico, es necesario probarlo in vivo. Con este fin, D. melanogaster representa un sistema de modelos válido. Hasta la fecha, la mosca de la fruta se ha utilizado ampliamente como modelo in vivo para evaluar los efectos de varias EDC ambientales; se ha informado de que la exposición a varios EDC, como el dibutilo ftalato (DBP)28,el bisfenol A (BPA), el 4-nonilfenol (4-NP), el 4-tert-octilfenol (4-tert-OP)29, el metilparabeno (MP)30, el etilparabeno (EP)31, 32, bis-(2-etilhexilo) ftalato (DEHP)33y 17-o-etinilestradiol (EE2)34, influye en el metabolismo y las funciones endocrinas como en los modelos de vertebrados. Varias razones han llevado a su uso como modelo en este campo de investigación. Más allá de un excelente conocimiento de sus sistemas endocrinos, otras ventajas incluyen su corto ciclo de vida, bajo costo, genoma fácilmente manipulable, una larga historia de investigación, y varias posibilidades técnicas (ver el sitio web de FlyBase, http://flybase.org/). D. melanogaster también proporciona un modelo potente para estudiar fácilmente los efectos transgeneracionales y las respuestas de la población a los factores ambientales8 y evita cuestiones éticas relevantes para los estudios in vivo en animales superiores. Además, la mosca de la fruta comparte un alto grado de conservación de genes con los seres humanos que podría hacer posible que los ensayos de Drosophila EDC ayuden a predecir o sugerir los efectos potenciales de estos productos químicos para la salud humana. Además de ampliar la comprensión sobre los efectos en la salud humana, Drosophila puede ayudar a evaluar los riesgos de exposición de la EDC al medio ambiente, como la pérdida de biodiversidad y la degradación del medio ambiente. Por último, la mosca de la fruta ofrece la ventaja adicional de ser utilizada en laboratorios, donde los factores que pueden afectar a su desarrollo, reproducción y vida útil pueden mantenerse bajo control con el fin de atribuir cualquier variación a la sustancia a probar.
Con esto en mente, hemos optimizado ensayos de fitness simples y robustos para determinar los efectos de la EDC en algunos rasgos hormonales de Drosophila, como la fecundidad/fertilidad, el tiempo de desarrollo y la vida útil de los adultos. Estos ensayos han sido ampliamente utilizados para algunos EDCs23,24,25,26,27. En particular, hemos utilizado los siguientes protocolos para evaluar los efectos de la exposición al estrógeno sintético EE234 y al BPA y al bisfenol AF (BPA F) (datos no publicados). Estos protocolos pueden modificarse fácilmente para investigar los efectos de una EDC dada a la vez, así como los efectos combinados de múltiples EDC en D. melanogaster.
Protocol
Representative Results
Discussion
La mosca de la fruta D. melanogaster ha sido ampliamente empleada como un sistema modelo in vivo para investigar los efectos potenciales de los EDC ambientales como DBP28,BPA, 4-NP, 4-tert-OP29, MP30, EP31, 32, DEHP33y EE234. Varias razones han llevado a su uso como modelo en este campo de investigación. Aparte de sus ventajas indiscu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Orsolina Petillo por su apoyo técnico. Los autores agradecen a la Dra. Mariarosaria Aletta (CNR) su apoyo bibliográfico. Los autores agradecen al Dr. Gustavo Damiano Mita por presentarlos al mundo de la EDC. Los autores agradecen a Leica Microsystems y Pasquale Romano por su ayuda. Esta investigación fue apoyada por el Proyecto PON03PE_00110_1. “Sviluppo di nanotecnologie Orientate alla Rigenerazione e Ricostruzione Tissutale, Implantologia e Sensoristica in Odontoiatria/oculistica” acronimo “SORRISO”; Compromiso: PO FESR 2014-2020 CAMPANIA; Proyecto PO FESR Campania 2007-2013 “NANOTECNOLOGIE PER IL RILASCIO CONTROLLATO DI MOLECOLE BIO-ATTIVE NANOTECNOLOGIE”.
Materials
| 17α-Ethinylestradiol | Sigma | E4876-1G | |
| Agar for Drosophila medium | BIOSIGMA | 789148 | |
| Bisphenol A | Sigma | 239658-50G | |
| Bisphenol AF | Sigma | 90477-100MG | |
| Cornmeal | CA' BIANCA | ||
| Diethyl ether | Sigma | ||
| Drosophila Vials | BIOSIGMA | 789008 | 25×95 mm |
| Drosophila Vials | BIOSIGMA | 789009 | 29×95 mm |
| Drosophila Vials | Kaltek | 187 | 22X63 |
| Embryo collection cage | Crafts | Plexiglass cylinder (12,5 x7 cm) with an open end and the other end closed by a rectangular base in which a slot allows the insertion of special trays for laying | |
| Ethanol | FLUKA | 2860 | |
| Etherizer | Crafts | cylindrical glass container with a cotton plug | |
| Glass Bottle | 250mL Bottles | ||
| Glass Vials | Microtech | ST 10024 | FLAT BOTTOM TUBE 100X24 |
| Hand blender Pimmy | Ariete | food processor | |
| Instant Success yeast | ESKA | Powdered yeast | |
| Laying tray | Crafts | plexiglass trays (11 x 2,6 cm) in wich to pour medium for laying | |
| Methyl4-hydroxybenzoate | SIGMA | H5501 | |
| Petri Dish | Falcon | 351016 | 60×5 |
| Red dye no. 40 | SIGMA | 16035 | |
| Stereomicroscope with LED lights | Leica | S4E | |
| Sucrose | HIMEDIA | MB025 | |
| Tomato sauce | Cirio |
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