Summary

Generatie van Organoids van muis Extrahepatic galwegen

Published: April 23, 2019
doi:

Summary

Dit protocol beschrijft de productie van een muis extrahepatic gal 3-dimensionale organoid kanaalsysteem. Deze biliaire organoids kan worden gehandhaafd in cultuur te bestuderen van cholangiocyte biologie. Biliaire organoids express markers van voorlopercellen zowel biliaire cellen en zijn samengesteld uit gepolariseerde epitheliale cellen.

Abstract

Cholangiopathies, die gevolgen hebben voor extrahepatic galwegen (EHBDs), bevatten biliaire atresie, acute primaire scleroserende cholangitis en cholangiocarcinoma. Ze hebben geen effectieve therapeutische opties. Hulpmiddelen om te studeren EHBD zijn zeer beperkt. Ons doel was het ontwikkelen van een orgel-specifieke, veelzijdig, volwassen stamcel-afgeleid, preklinische cholangiocyte model dat gemakkelijk kan worden gegenereerd vanuit wild type en genetisch gemodificeerde muizen. Dus rapporteren wij over de nieuwe techniek van de ontwikkeling van een EHBD organoid (EHBDO) cultuur systeem van volwassen muis EHBDs. Het model is kostenefficiënt, kunnen gemakkelijk worden geanalyseerd, en heeft meerdere downstream toepassingen. Specifiek, beschrijven we de methodologie van muis EHBD isolatie en eencellige dissociatie, organoid cultuur initiatie, voortplanting, en op lange termijn onderhoud en opslag. Dit manuscript wordt ook beschreven EHBDO verwerking voor immunohistochemistry, fluorescent microscopie en mRNA overvloed kwantificatie door real-time kwantitatieve omgekeerde transcriptie polymerase-kettingreactie (qRT-PCR). Dit protocol heeft belangrijke voordelen naast EHBD-specifieke organoids produceren. Het gebruik van een geconditioneerde medium uit L-WRN cellen aanzienlijk vermindert de kosten van dit model. Het gebruik van de muis EHBDs biedt bijna onbeperkte weefsel voor cultuur generatie, in tegenstelling tot menselijk weefsel. Gegenereerde muis EHBDOs bevatten een zuivere bevolking van epitheliale cellen met markeringen van endodermal voorlopercellen en gedifferentieerde biliaire cellen. Gekweekte organoids handhaven van homogene morfologie door meerdere passages en kunnen worden hersteld na een langdurige opslagperiode in vloeibare stikstof. Het model staat voor de studie van biliaire progenitor celproliferatie, farmacologisch kan worden gemanipuleerd en kan worden gegenereerd op basis van genetisch gemodificeerde muizen. Toekomstige studies zijn nodig om het optimaliseren van de kweekomstandigheden om efficiëntie van de beplating, evalueren functionele cel volwassenheid, en directe celdifferentiatie. Ontwikkeling van co cultuur modellen en een meer biologisch neutraal extracellulaire matrix zijn ook wenselijk.

Introduction

Cholangiopathies zijn ongeneeslijke chronische progressieve aandoeningen die invloed hebben op biliaire cellen gelegen in intra- en extrahepatic biliaire leidingen (EHBDs)1. Sommige cholangiopathies, zoals acute primaire scleroserende cholangitis, cholangiocarcinoma, biliaire atresie en choledochal cysten, is hoofdzakelijk van invloed op EHBDs. Ontwikkeling van therapieën voor cholangiopathies wordt beperkt door de beperkte beschikbaarheid van preklinische modellen. Bovendien, eerdere studies gericht op cholangiopathies gegroepeerd: lever, intra- en EHBDs. Echter, intra- en EHBDs hebben een aparte embryonale oorsprong en, dus, moet worden beschouwd als afzonderlijke moleculaire pathologie. Intrahepatische galwegen ontwikkelen van de Intrahepatische ductaal platen en de craniale deel van hepatische diverticulum, de ontwikkeling van de hele EHBDs van de staartzijde van het hepatische diverticulum2. Zij vertrouwen ook op verschillende progenitor cel compartimenten voor volwassen homeostase, met inbegrip van grachten van Hering in Intrahepatische galwegen en peribiliary klieren in EHBDs2,3. Gebruik van diermodellen voor preklinische studies wordt beperkt door de kosten en moet worden geminimaliseerd om ethische redenen. Daarom zijn reductionistische, reproduceerbaar, tijd en kosten-efficiënte in-vitro modellen zeer wenselijk.

Meeste voorafgaande studies van cholangiopathies gebruikt normale muis of rat kanker modellen, of menselijke cholangiocarcinoma cellijnen afgeleid van intra- en EHBDs4,,5,,6,7. Echter, deze zijn modellen van getransformeerde cellen en doen niet recapituleren normale cholangiocyte biologie op homeostase of in een gezonde staat. Recente vooruitgang in de ontwikkeling van organotypic cultuur modellen heeft toegestaan de ontwikkeling van 3-dimensionale structuren van de verschillende weefselsoorten, met inbegrip van hepatobiliaire weefsels, hoewel niet normale muis EHBDs8,9, 10. Deze structuren “orgel-achtige” gericht op het nabootsen van primaire weefsel en worden geteeld in een kunstmatige niche ondersteuning zelf-vernieuwing van de orgel-specifieke stam/voorlopercellen cellen11.

“Organoid” is een brede term die de meeste vaak beschrijft 3-dimensionale weefsel modellen afgeleid van stamcellen. Organoids kan worden gegenereerd vanuit geherprogrammeerde pluripotente stamcellen vertegenwoordigd door embryonale stamcellen en geïnduceerde pluripotente stamcellen. Ze kunnen ook worden gegenereerd vanuit orgel-specifieke adulte stamcellen12. Sommige cholangiocyte organoid modellen zijn voorgesteld in vorige onderzoeken. Dus, organoids afgeleid van menselijke pluripotente stamcellen zijn gerapporteerde7,9,13 en bieden een waardevolle, tijd efficiënt hulpmiddel waarmee voor gelijktijdige opwekking van verschillende celtypes. Echter komen deze pluripotente stamcel afkomstige organoids niet volledig overeen met de structuur en de functionaliteit van primaire volwassen EHBD cholangiocytes.

Organoids afgeleid van adulte stamcellen van het menselijke9 en katachtige10 lever werden ook voorgesteld. Katachtige modellen zijn niet overal verkrijgbaar en hebben beperkte hulpprogramma arsenaal voor studiedoeleinden. Deze lever afkomstige volwassen stamcel afkomstige organoids doen bovendien niet extrahepatic cholangiocytes maar eerder Intrahepatische cholangiocytes model.

EHBD organoid generatie werd gemeld uit menselijke normale EHBDs14 en muis EHBD cholangiocarcinoma15. Echter toegang tot menselijke weefsels EHBD is zeer beperkt, en organoids afgeleid van een genetische lymfkliertest model van cholangiocarcinoma15 vertegenwoordigen niet gezond cholangiocyte biologie aan homeostase en zijn afgeleid van genetisch gemodificeerde cellen.

Om de beperkingen van pluripotente stamcel – en lever-afgeleide cholangiocyte organoid modellen en de beperkte toegang tot menselijke weefsels, in preklinische modellen nodig, ontwikkelden we een lymfkliertest EHBD organoid model (figuur 1A). Dit manuscript beschrijft de ontwikkeling van een techniek voor muis EHBD afkomstige organoids uit volwassen weefsel. Deze EHBD organoids genaamd EHBDOs zal een belangrijk in vitro instrument zijn voor de studie van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de EHBDs cholangiocyte homeostase en ziekte processen, zoals cholangiopathies.

Protocol

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Universiteit van Michigan. 1. bereiding van uitrusting en materiaal voor muis EHBD isolatie Bereiden seeding medium en wassen buffer (Tabel van materialen) in 50 mL conische buizen en houden hen bij 4 ° C of op ijs tot gebruik. Een chirurgische tabel (figuur 1B) instellen. Bereiden gesteriliseerde chir…

Representative Results

Ons protocol beschrijft de generatie van muis EHBD organoids die weefsel-specifieke en volwassen stamcel-afgeleide. Nadat de organoids worden gekweekt, kan een cystic Structuurformatie zo spoedig 1 dag na de EHBD-isolatie worden waargenomen. Besmetting met fibroblasten meestal niet wordt nageleefd tijdens het genereren van de cultuur. EHBDO plating efficiëntie is ongeveer 2% wanneer geïsoleerd van neonatale of volwassen (ouder dan 2 maanden) muizen (figuur 2B</stron…

Discussion

Dit werk beschrijft de generatie van een 3-dimensionaal model van de organotypic van muis EHBD cholangiocytes. Belangrijke stappen in de EHBDO cultuur generatie omvatten nauwgezet EHBD dissectie Voorkom alvleesklier cel besmetting, onderhoud van steriele omstandigheden ter voorkoming van bacteriële en schimmelinfecties besmetting en zorgvuldige manipulatie na het centrifugeren om te voorkomen dat de verlies van celmateriaal. Een nauwe aanhankelijkheid aan beschreven temperatuursomstandigheden is vereist. Er zijn enkele …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gesteund door de Amerikaanse Vereniging voor de studie van lever ziekten Pinnacle award (naar N.R.) en de National Institutes of Health, nationale Instituut van Diabetes en spijsverterings- en nierziekten (awards P30 DK34933 aan N.R., P01 DK062041 aan J.L.M.). Wij danken Dr. Ramon Ocadiz-Ruiz (University of Michigan) voor zijn hulp bij de ontwikkeling van deze methode.

Materials

L-WRN cell culture medium
Advanced DMEM/F12 Life Technologies 12634-010
Fetal Bovine Serum (FBS) 1% Life Technologies 10437-028
Penicillin-Streptomycin 100 U/mL Life Technologies 15140-122
Washing buffer
Phosphate Buffered Saline (PBS) 50 mL Life Technologies 10010-023
Penicillin-Streptomycin 125 U/mL Life Technologies 15140-122
Amphotericin B  6.25 µg/mL Life Technologies 15290-018
Organoid culture medium
L-WRN Conditioned medium  1:1 ATCC CRL-3276
Advanced DMEM/F12 1:1 Life Technologies 12634-010
Penicillin-Streptomycin 100 U/mL Life Technologies 15140-122
N-Glutamine 10 µl/mL Life Technologies 35050-061
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid, HEPES 10 mM Life Technologies 15630-080
B27 10 µl/mL Gibco 17504-044
N2 10 µl/mL Gibco 17502-048
Organoid seeding medium
Organoid culture medium 
Epidermal growth factor (EGF) 50 ng/mL Invitrogen PMG8041
Fibroblast growth factor-10 (FGF10) 100 ng/mL PeproTech 100-26
Primary antibodies
Anti-Cytokeratin 19 (CK19) antibody, Rabbit 1:250 Abcam ab53119
Sex-Determining Region Y-Box 9 (SOX9) antibody, Rabbit 1:200 Santa Cruz sc-20095
Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX1) antibody, Rabbit 1:2000 DSRB F109-D12
E-cadherin antibody, Goat 1:500 Santa Cruz sc-31020
Acetylated α-tubulin antibody, Mouse 1:500 Sigma-Aldrich T6793
Secondary antibodies
488 labeled anti-rabbit, Donkey IgG 1:1000 Invitrogen A-21206
594 labeled anti-goat, Donkey IgG 1:1000 Invitrogen A-11058
568 labeled anti-mouse, Goat IgG2b 1:500 Invitrogen A-21144
TopFlash Wnt reporter assay
TopFlash HEK293 cell line ATCC CRL-1573
Luciferase Assay Kit Biotium 30003-2
0.05% Trypsin-EDTA Life Technologies 25300054
0.4% Trypan Blue Solution Life Technologies 15250061
Additional materials and reagents
Basement matrix, phenol free Matrigel CORNING 356237
Dissociation buffer, Accutase Gibco A1110501
Cell culture freezing medium, Recovery Life Technologies 12648010
Cell strainer (70 µm, steriled) Fisherbrand 22363548
Guanidinium thiocyanate-phenol RNA extraction, TRIzol Invitrogen 15596026
Specimen processing gel, HistoGel Thermo Fisher Scientific HG-4000-012
Universal mycoplasma detection kit ATCC 30-1012K
1.5 mL microcentrifuge tube Fisherbrand 05-408-129
24 well plate USA Scientific CC7682-7524
50 mL conical centrifuge tube Fisher scientific 14-432-22
Fluorescence microscope Nikon Eclipse E800
Inverted microscope Biotium 30003-2
Necropsy tray Fisherbrand 13-814-61

References

  1. Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F. The Cholangiopathies. Mayo Clinic Proceedings. 90 (6), 791-800 (2015).
  2. Carpino, G., et al. Stem/Progenitor Cell Niches Involved in Hepatic and Biliary Regeneration. Stem Cells International. 2016, 3658013 (2016).
  3. DiPaola, F., et al. Identification of intramural epithelial networks linked to peribiliary glands that express progenitor cell markers and proliferate after injury in mice. Hepatology. 58 (4), 1486-1496 (2013).
  4. Venter, J., et al. Development and functional characterization of extrahepatic cholangiocyte lines from normal rats. Digestive And Liver Disease. 47 (11), 964-972 (2015).
  5. Glaser, S. S., et al. Morphological and functional heterogeneity of the mouse intrahepatic biliary epithelium. Laboratry Investigation. 89 (4), 456-469 (2009).
  6. Cardinale, V., et al. Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets. Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).
  7. De Assuncao, T. M., et al. Development and characterization of human-induced pluripotent stem cell-derived cholangiocytes. Laboratry Investigation. 95 (6), 684-696 (2015).
  8. Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
  9. Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
  10. Kruitwagen, H. S., et al. Long-Term Adult Feline Liver Organoid Cultures for Disease Modeling of Hepatic Steatosis. Stem Cell Reports. 8 (4), 822-830 (2017).
  11. Spence, J. R. Taming the Wild West of Organoids, Enteroids, and Mini-Guts. Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 5 (2), 159-160 (2018).
  12. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends In Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
  13. Sampaziotis, F. Building better bile ducts. Science. 359 (6380), 1113 (2018).
  14. Sampaziotis, F., et al. Reconstruction of the mouse extrahepatic biliary tree using primary human extrahepatic cholangiocyte organoids. Nature Medicine. 23 (8), 954-963 (2017).
  15. Nakagawa, H., et al. Biliary epithelial injury-induced regenerative response by IL-33 promotes cholangiocarcinogenesis from peribiliary glands. Proceedings Of The Natural Academy Of Science Of The United States Of America. 114 (19), E3806-E3815 (2017).
  16. Razumilava, N. Hedgehog signaling modulates IL-33-dependent extrahepatic bile duct cell proliferation in mice. Hepatology Communications. , (2018).
  17. Boyer, J. L. Bile formation and secretion. Comprehensive Physiology. 3 (3), 1035-1078 (2013).
  18. Carpino, G., et al. Biliary tree stem/progenitor cells in glands of extrahepatic and intraheptic bile ducts: an anatomical in situ study yielding evidence of maturational lineages. Journal Of Anatomy. 220 (2), 186-199 (2012).
  19. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
  20. Williamson, I. A., et al. A High-Throughput Organoid Microinjection Platform to Study Gastrointestinal Microbiota and Luminal Physiology. Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).
  21. Wan, A. C. A. Recapitulating Cell-Cell Interactions for Organoid Construction – Are Biomaterials Dispensable?. Trends In Biotechnology. 34 (9), 711-721 (2016).

Play Video

Cite This Article
Shiota, J., Zaki, N. H. M., Merchant, J. L., Samuelson, L. C., Razumilava, N. Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts. J. Vis. Exp. (146), e59544, doi:10.3791/59544 (2019).

View Video