Summary

Génération d’Organoïdes des voies biliaires extrahépatiques souris

Published: April 23, 2019
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Summary

Ce protocole décrit la production d’une souris biliaires extrahépatiques organoïde 3-dimensions. Ces organoïdes biliaires peuvent être maintenues en culture pour étudier la biologie cholangiocyte. Organoïdes biliaires expriment des marqueurs des cellules biliaires et géniteur et sont composées de cellules épithéliales polarisées.

Abstract

Cholangiopathies, d’affecter des canaux biliaires extrahépatiques (EHBDs), incluent l’atrésie des voies biliaires, la cholangite sclérosante primitive et cholangiocarcinome. Ils n’ont aucune option thérapeutique efficace. Outils pour étudier les EHBD sont très limitées. Notre but était d’élaborer un modèle de certains organes, polyvalent, adulte cholangiocyte de cellules souches dérivées, précliniques qui peut être facilement généré de type sauvage et des souris génétiquement modifiées. Ainsi, nous présentons la nouvelle technique de mettre au point un système de culture organoïde (EHBDO) EHBD de EHBDs de souris adulte. Le modèle est rentable, capable de doser facilement, et a de multiples applications en aval. Plus précisément, nous décrivons la méthodologie d’isolement EHBD souris et dissociation cellulaire unique, initiation de culture organoïde, propagation et maintenance à long terme et stockage. Ce manuscrit a aussi décrit EHBDO traitement pour immunohistochimie, microscopie fluorescente et quantification d’abondance ARNm en chaîne par polymérase quantitative en temps réel de la transcription inverse (qRT-PCR). Ce protocole a des avantages significatifs en plus de produire EHBD spécifique organoïdes. L’utilisation d’un milieu conditionné de cellules L-AVT réduit significativement le coût de ce modèle. L’utilisation de souris EHBDs fournit presque illimitée de tissus pour la production de la culture, à la différence des tissus humains. EHBDOs souris générés contiennent une population pure de cellules épithéliales avec des marqueurs de progéniteurs endodermiques et différencient de cellules biliaires. Organoïdes cultivées maintiennent morphologie homogène à travers les passages multiples et peuvent être récupérés après une longue période de stockage dans l’azote liquide. Le modèle permet l’étude de la prolifération des cellules progénitrices biliaire, peut être manipulé sur le plan pharmacologique et peut être généré à partir des souris génétiquement modifiées. Les études à venir sont nécessaires pour optimiser les conditions de culture afin d’accroître l’efficacité de l’électrodéposition, d’évaluer la maturité fonctionnelle cellulaire et la différenciation cellulaire directe. Développement de modèles de culture mixte et une matrice extracellulaire plus biologiquement neutre sont également souhaitables.

Introduction

Cholangiopathies sont incurables chroniques progressive des troubles qui affectent les cellules biliaires situés intra – et les canaux biliaires extrahépatiques (EHBDs)1. Certains cholangiopathies, tels que la cholangite sclérosante primitive, cholangiocarcinome, atrésie des voies biliaires et kystes cholédocien, affectent principalement EHBDs. Mise au point de thérapies pour les cholangiopathies est limitée par la disponibilité limitée des modèles précliniques. En outre, des études antérieures concentrent cholangiopathies regroupés : foie, intra- et EHBDs. Cependant, intra – et EHBDs ont une origine embryonnaire distinct et devraient donc être considérés comme des pathologies moléculaires distinctes. Voies biliaires intrahépatiques se développent à partir des plaques canalaires intrahépatiques et la partie crâniale du diverticule hépatique, EHBDs ensemble se développent à partir de la partie caudale du diverticule hépatique2. Ils comptent également sur les compartiments cellulaires différentes souches pour l’homéostasie adulte, y compris les canaux de Hering dans les voies biliaires intrahépatiques et glandes péribiliaires EHBDs2,3. Utilisation de modèles animaux pour des études précliniques est limitée par la dépense et devrait être réduite au minimum pour des raisons éthiques. Réductionniste, reproductible, temps et coût-efficace modèles in vitro sont donc hautement souhaitables.

La plupart des études préalables de cholangiopathies utilisé des souris normales ou modèles de cancer de rat ou lignées de cellules de cholangiocarcinome humain dérivées intra – et EHBDs4,5,6,7. Cependant, ceux-ci sont des modèles de cellules transformées et récapituler pas normal cholangiocyte biologie à l’homéostasie, ou dans un état sain. Les progrès récents dans l’élaboration de modèles de culture organotypique a permis le développement de structures 3D de types de tissus différents, y compris les tissus hépato-biliaire, bien que les souris normale non EHBDs8,9, 10. Ces structures en « orgue » visant à imitant le tissu principal et sont cultivés dans une niche artificielle soutenant l’auto-renouvellement des cellules de certains organes souches/progénitrices11.

« Organoïde » est un large mandat qui est plus communément décrit les modèles de tissus 3 dimensions dérivées de cellules souches. Organoïdes peut être généré de reprogrammé pluripotentes cellules souches représentée par des cellules souches embryonnaires et induit des cellules souches pluripotentes. Ils peuvent également être générés d’organe-spécifiques des cellules souches adultes12. Certains modèles d’organoïde cholangiocyte ont été proposées dans les études précédentes. Ainsi, organoïdes dérivés de cellules souches pluripotentes humaines ont été déclarés7,9,13 et fournissent un outil efficace de temps précieux, qui permet la production simultanée de différents types cellulaires. Cependant, ces organoïdes de dérivés de cellules souches pluripotentes ne reflètent pas totalement la structure et les fonctionnalités de primaire adulte EHBD biliaires.

Organoïdes dérivées de cellules souches adultes de l’ humain9 et féline10 du foie ont également été proposées. Féline de modèles ne sont pas largement disponibles et ont limité la panoplie d’outil à des fins d’étude. En outre, ces organoïdes de dérivés de cellules souches adultes provenant du foie ne pas poser biliaires extrahépatiques mais biliaires intrahépatiques plutôt.

Génération d’organoïde EHBD humaine normale EHBDs14 et la souris EHBD cholangiocarcinome15a été signalée. Cependant, l’accès pour les tissus humains de EHBD est extrêmement limité et organoïdes dérivés d’un modèle murin de cholangiocarcinome15 ne représentent pas de biologie cholangiocyte sain à l’homéostasie et proviennent de cellules génétiquement modifiées.

Pour pallier les lacunes des pluripotentes dérivées de cellules souches et de foie cholangiocyte organoïde modèles et l’accès limité aux tissus humains nécessaires dans les modèles précliniques, nous avons développé un modèle murin d’organoïde EHBD (Figure 1 a). Ce manuscrit décrit le développement d’une technique pour souris organoïdes EHBD dérivées de tissus adultes. Ces organoïdes EHBD nommés EHBDOs sera un outil important in vitro pour l’étude des mécanismes sous-jacents à l’EHBDs cholangiocyte l’homéostasie et maladie processus, tels que cholangiopathies.

Protocol

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université du Michigan. 1. préparation du matériel et matériaux pour l’Isolation EHBD souris Préparer les semis moyen et tampon de lavage (Table des matières) dans 50 mL tubes coniques et garder à 4 ° C ou sur la glace jusqu’à l’utilisation. Mettre en place une table d’opération chirurgicale (Fig…

Representative Results

Notre protocole décrit la génération de souris EHBD organoïdes qui sont spécifiques des tissus et cellules souches dérivées d’adulte. Après que les organoïdes sont cultivées, une formation des structures kystiques peut être observée dès 1 jour après l’isolement du EHBD. Contamination par les fibroblastes n’est pas typiquement observée pendant la génération de la culture. EHBDO efficacité de placage est environ 2 % lorsqu’il est isolé depuis néonatale ou adulte …

Discussion

Cet ouvrage décrit la génération d’un modèle 3-dimensional organotypique de souris EHBD biliaires. Des étapes importantes dans la production de la culture EHBDO incluent la dissection méticuleuse de EHBD pour éviter la contamination de cellules de pancréas, maintien des conditions stériles pour prévenir la contamination bactérienne et fongique et manipulation prudente après centrifugation afin d’éviter la perte du matériel cellulaire. Il faut une étroite adhésion aux conditions de température décrit…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par l’Association américaine pour l’étude du foie, maladies Pinnacle prix (N.R.) et le National Institutes of Health, National Institute of Diabetes et Digestive and Kidney Diseases (prix DK34933 P30 à N.R., P01 DK062041 à J.L.M.). Nous remercions le Dr Ramon Ocadiz-Ruiz (Université du Michigan) pour son aide au développement de cette méthodologie.

Materials

L-WRN cell culture medium
Advanced DMEM/F12 Life Technologies 12634-010
Fetal Bovine Serum (FBS) 1% Life Technologies 10437-028
Penicillin-Streptomycin 100 U/mL Life Technologies 15140-122
Washing buffer
Phosphate Buffered Saline (PBS) 50 mL Life Technologies 10010-023
Penicillin-Streptomycin 125 U/mL Life Technologies 15140-122
Amphotericin B  6.25 µg/mL Life Technologies 15290-018
Organoid culture medium
L-WRN Conditioned medium  1:1 ATCC CRL-3276
Advanced DMEM/F12 1:1 Life Technologies 12634-010
Penicillin-Streptomycin 100 U/mL Life Technologies 15140-122
N-Glutamine 10 µl/mL Life Technologies 35050-061
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid, HEPES 10 mM Life Technologies 15630-080
B27 10 µl/mL Gibco 17504-044
N2 10 µl/mL Gibco 17502-048
Organoid seeding medium
Organoid culture medium 
Epidermal growth factor (EGF) 50 ng/mL Invitrogen PMG8041
Fibroblast growth factor-10 (FGF10) 100 ng/mL PeproTech 100-26
Primary antibodies
Anti-Cytokeratin 19 (CK19) antibody, Rabbit 1:250 Abcam ab53119
Sex-Determining Region Y-Box 9 (SOX9) antibody, Rabbit 1:200 Santa Cruz sc-20095
Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX1) antibody, Rabbit 1:2000 DSRB F109-D12
E-cadherin antibody, Goat 1:500 Santa Cruz sc-31020
Acetylated α-tubulin antibody, Mouse 1:500 Sigma-Aldrich T6793
Secondary antibodies
488 labeled anti-rabbit, Donkey IgG 1:1000 Invitrogen A-21206
594 labeled anti-goat, Donkey IgG 1:1000 Invitrogen A-11058
568 labeled anti-mouse, Goat IgG2b 1:500 Invitrogen A-21144
TopFlash Wnt reporter assay
TopFlash HEK293 cell line ATCC CRL-1573
Luciferase Assay Kit Biotium 30003-2
0.05% Trypsin-EDTA Life Technologies 25300054
0.4% Trypan Blue Solution Life Technologies 15250061
Additional materials and reagents
Basement matrix, phenol free Matrigel CORNING 356237
Dissociation buffer, Accutase Gibco A1110501
Cell culture freezing medium, Recovery Life Technologies 12648010
Cell strainer (70 µm, steriled) Fisherbrand 22363548
Guanidinium thiocyanate-phenol RNA extraction, TRIzol Invitrogen 15596026
Specimen processing gel, HistoGel Thermo Fisher Scientific HG-4000-012
Universal mycoplasma detection kit ATCC 30-1012K
1.5 mL microcentrifuge tube Fisherbrand 05-408-129
24 well plate USA Scientific CC7682-7524
50 mL conical centrifuge tube Fisher scientific 14-432-22
Fluorescence microscope Nikon Eclipse E800
Inverted microscope Biotium 30003-2
Necropsy tray Fisherbrand 13-814-61

References

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Cite This Article
Shiota, J., Zaki, N. H. M., Merchant, J. L., Samuelson, L. C., Razumilava, N. Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts. J. Vis. Exp. (146), e59544, doi:10.3791/59544 (2019).

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