Geração de Organoids de vias biliares extra-hepáticas Mouse
Summary
Este protocolo descreve a produção de um sistema de 3-dimensional organoides biliar extra-hepática do mouse. Estes organoids biliares podem ser mantidas em cultura para estudar Biologia cholangiocyte. Organoids biliares expressar marcadores do progenitor e células biliares e são compostos de células epiteliais polarizadas.
Abstract
Cholangiopathies, que afectam os ductos biliares extra-hepáticas (EHBDs), incluem atresia biliar, colangite esclerosante primária e colangiocarcinoma. Eles não têm nenhuma opção terapêutica eficaz. Ferramentas para estudar EHBD são muito limitadas. Nosso objetivo foi desenvolver um modelo de órgão específico, versátil, adulto pré-clínicos, células-tronco derivadas de cholangiocyte que pode ser facilmente gerado de tipo selvagem e camundongos geneticamente modificados. Assim, relatamos a nova técnica de desenvolvimento de um sistema de cultura de organoides (EHBDO) EHBD de EHBDs de rato adulto. O modelo é custo-eficiente, capaz de ser prontamente analisadas, e tem múltiplas aplicações a jusante. Especificamente, descrevemos a metodologia de isolamento de EHBD de rato e dissociação de célula única, iniciação de cultura organoides, propagação e manutenção a longo prazo e armazenamento. Este manuscrito também descreve EHBDO processamento de imuno-histoquímica, microscopia fluorescente e quantificação de abundância de mRNA pela reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa transcrição reversa (qRT-PCR). Este protocolo tem vantagens significativas, além de produzir organoids EHBD específicos. O uso de um meio condicionado de células L-WRN reduz significativamente o custo deste modelo. O uso do mouse EHBDs fornece tecido quase ilimitado para geração de cultura, ao contrário de tecido humano. EHBDOs rato gerado contêm uma população pura de células epiteliais com marcadores de endodermal progenitor e biliares células diferenciadas. Organoids cultivadas manter homogénea morfologia através de múltiplas passagens e podem ser recuperados após um período de armazenamento a longo prazo em nitrogênio líquido. O modelo permite o estudo da proliferação das células progenitoras biliar, pode ser manipulado farmacologicamente e pode ser gerado a partir de camundongos geneticamente modificados. Futuros estudos são necessários para otimizar as condições de cultura a fim de aumentar a eficiência do chapeamento, avaliar a maturidade funcional celular e diferenciação celular direto. Desenvolvimento de modelos de co-cultura e uma matriz extracelular mais biologicamente neutro também são desejáveis.
Introduction
Cholangiopathies são incuráveis crônicos progressivos distúrbios que afetam as células biliares localizadas no intrae canais biliares extra-hepáticas (EHBDs)1. Alguns cholangiopathies, como Colangiocarcinoma, colangite esclerosante primária, atresia biliar e cistos coledocianos, afetam predominantemente EHBDs. Desenvolvimento de terapias para cholangiopathies é restringido pela disponibilidade limitada de modelos pré-clínicos. Além disso, estudos anteriores focada em cholangiopathies agrupados: fígado, intrae EHBDs. No entanto, intrae EHBDs têm uma origem embrionária distinta e, portanto, devem ser consideradas distintas patologias moleculares. Biliares intra-hepáticos se desenvolvem a partir das placas intra Ductais e a parte cranial do divertículo hepático, EHBDs todo desenvolvem da parte caudal do divertículo hepático2. Eles também contam com compartimentos de células progenitoras diferentes para homeostase adulto, incluindo canais de Hering em glândulas de peribiliary em EHBDs2,3e biliares intra-hepáticos. Utilização de modelos animais para estudos pré-clínicos é limitada pela despesa e deve ser minimizada por razões éticas. Portanto, reducionista, reprodutível, tempo e custo-eficiente modelos in vitro são altamente desejáveis.
A maioria dos estudos prévios de cholangiopathies utilizaram rato normal ou modelos de câncer do rato ou linhas de células humanas Colangiocarcinoma derivadas intrae EHBDs4,5,6,7. No entanto, estes são modelos de células transformadas e não recapitular biologia cholangiocyte normal em homeostase ou em um estado saudável. Recentes progressos no desenvolvimento de modelos de cultura organotypic permitiu o desenvolvimento de estruturas 3-dimensional de tipos de tecido diferentes, incluindo tecidos de vilosidades, embora não normal do rato EHBDs8,9, 10. Estes “órgãos” estruturas destinadas a imitando tecido primário e são cultivadas em um nicho artificial apoiando auto-renovação de células tronco/progenitoras de órgão específico11.
“Organoides” é um amplo termo que mais comumente descreve modelos de tecido 3-dimensional derivados de células-tronco. Organoids podem ser gerados de pluripotentes reprogramadas, células-tronco representado por células-tronco embrionárias e induzido por células-tronco pluripotentes. Eles também podem ser gerados a partir de células-tronco adultas órgão específico12. Alguns modelos de organoides cholangiocyte têm sido propostos em estudos anteriores. Assim, organoids, derivados de células-tronco pluripotentes humanas têm sido relatados7,9,13 e fornecer um tempo valioso, eficiente ferramenta que permite a geração simultânea de diferentes tipos de células. No entanto, essas organoids de células-tronco derivadas de pluripotentes não refletem totalmente a estrutura e a funcionalidade do adulto primário EHBD cholangiocytes.
Organoids derivados de células-tronco adultas do humano9 e felino10 fígado também foram propostos. Modelos de felinos não estão amplamente disponíveis e limitaram o arsenal de ferramentas para fins de estudo. Além disso, estes organoids células-tronco derivadas adultos derivado de fígado não modelo cholangiocytes extra-hepática mas prefiro intra-hepática cholangiocytes.
Geração de organoides EHBD foi relatada de humano normal EHBDs14 e mouse EHBD Colangiocarcinoma15. No entanto, acesso ao tecido EHBD humano é extremamente limitado, e organoids derivados de um modelo murino genético de colangiocarcinoma15 não representam saudável cholangiocyte biologia na homeostase e são derivadas de células geneticamente modificadas.
Para lidar com as limitações dos modelos organoides cholangiocyte de células-tronco e fígado-derivadas de pluripotentes e o acesso limitado aos tecidos humanos necessários em modelos pré-clínicos, desenvolvemos um modelo murino de organoides EHBD (figura 1A). Este manuscrito descreve o desenvolvimento de uma técnica para mouse organoids EHBD-derivado de tecido adulto. Estes organoids EHBD chamados EHBDOs será uma importante ferramenta in vitro para o estudo dos mecanismos subjacentes EHBDs cholangiocyte homeostase e doença de processos, tais como cholangiopathies.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este trabalho descreve a geração de um modelo de 3-dimensional organotypic do mouse cholangiocytes EHBD. Passos importantes na geração de cultura EHBDO incluem minuciosa dissecação de EHBD para evitar a contaminação de células do pâncreas, manutenção de condições estéreis para evitar a contaminação bacteriana e fúngica e manipulação cuidadosa após a centrifugação, para evitar o perda de material celular. Uma estreita aderência às condições descritas de temperatura é necessária. Existem alguma…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Associação Americana para o estudo do fígado doenças Pinnacle award (para S.O.) e o National Institutes of Health, Instituto Nacional de Diabetes e digestivo e doenças renais (prêmios P30 DK34933 de S.O., P01 DK062041 para J.L.M.). Agradecemos o Dr. Ramon Ocadiz-Ruiz (Universidade de Michigan) pela ajuda com o desenvolvimento desta metodologia.
Materials
| L-WRN cell culture medium | |||
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | 1% | Life Technologies | 10437-028 |
| Penicillin-Streptomycin | 100 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| Washing buffer | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | 50 mL | Life Technologies | 10010-023 |
| Penicillin-Streptomycin | 125 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| Amphotericin B | 6.25 µg/mL | Life Technologies | 15290-018 |
| Organoid culture medium | |||
| L-WRN Conditioned medium | 1:1 | ATCC | CRL-3276 |
| Advanced DMEM/F12 | 1:1 | Life Technologies | 12634-010 |
| Penicillin-Streptomycin | 100 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| N-Glutamine | 10 µl/mL | Life Technologies | 35050-061 |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid, HEPES | 10 mM | Life Technologies | 15630-080 |
| B27 | 10 µl/mL | Gibco | 17504-044 |
| N2 | 10 µl/mL | Gibco | 17502-048 |
| Organoid seeding medium | |||
| Organoid culture medium | |||
| Epidermal growth factor (EGF) | 50 ng/mL | Invitrogen | PMG8041 |
| Fibroblast growth factor-10 (FGF10) | 100 ng/mL | PeproTech | 100-26 |
| Primary antibodies | |||
| Anti-Cytokeratin 19 (CK19) antibody, Rabbit | 1:250 | Abcam | ab53119 |
| Sex-Determining Region Y-Box 9 (SOX9) antibody, Rabbit | 1:200 | Santa Cruz | sc-20095 |
| Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX1) antibody, Rabbit | 1:2000 | DSRB | F109-D12 |
| E-cadherin antibody, Goat | 1:500 | Santa Cruz | sc-31020 |
| Acetylated α-tubulin antibody, Mouse | 1:500 | Sigma-Aldrich | T6793 |
| Secondary antibodies | |||
| 488 labeled anti-rabbit, Donkey IgG | 1:1000 | Invitrogen | A-21206 |
| 594 labeled anti-goat, Donkey IgG | 1:1000 | Invitrogen | A-11058 |
| 568 labeled anti-mouse, Goat IgG2b | 1:500 | Invitrogen | A-21144 |
| TopFlash Wnt reporter assay | |||
| TopFlash HEK293 cell line | ATCC | CRL-1573 | |
| Luciferase Assay Kit | Biotium | 30003-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| 0.4% Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15250061 | |
| Additional materials and reagents | |||
| Basement matrix, phenol free Matrigel | CORNING | 356237 | |
| Dissociation buffer, Accutase | Gibco | A1110501 | |
| Cell culture freezing medium, Recovery | Life Technologies | 12648010 | |
| Cell strainer (70 µm, steriled) | Fisherbrand | 22363548 | |
| Guanidinium thiocyanate-phenol RNA extraction, TRIzol | Invitrogen | 15596026 | |
| Specimen processing gel, HistoGel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | |
| Universal mycoplasma detection kit | ATCC | 30-1012K | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| 24 well plate | USA Scientific | CC7682-7524 | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Fisher scientific | 14-432-22 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | Eclipse E800 | |
| Inverted microscope | Biotium | 30003-2 | |
| Necropsy tray | Fisherbrand | 13-814-61 |
References
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