यह प्रोटोकॉल एक माउस प्रत्यययकृत पित्त वाहिनी 3 आयामी अंगोइड प्रणाली के उत्पादन का वर्णन करता है । इन पित्त ऑर्गेनॉयड संस्कृति में रखा जा सकता है cholangiocyte जीवविज्ञान का अध्ययन । बिलियरी आर्गेनॉइड, दोनों प्रजनक और पित्त कोशिकाओं के मार्कर को अभिव्यक्त करता है और ध्रुवित उपकला कोशिकाओं से बना होता है ।
Cholangiopathies, जो प्रत्यययकृत पित्त नलिकाओं (EHBDs) को प्रभावित करते हैं, पित्त अविवरता, प्राथमिक स्कलेरोसिंग चोलवाहिकाशोथ, और cholangiopathies शामिल हैं । वे कोई प्रभावी उपचारात्मक विकल्प नहीं है । EHBD का अध्ययन करने के लिए उपकरण बहुत सीमित हैं । हमारा उद्देश्य एक अंग के विकास के लिए विशिष्ट, बहुमुखी, वयस्क स्टेम सेल व्युत्पंन, पूर्व नैदानिक cholangiocyte मॉडल है कि आसानी से जंगली प्रकार और आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहों से उत्पंन किया जा सकता है । इस प्रकार, हम वयस्क माउस Ehbd से एक EHBD आर्गेनोइड (EHBD) संस्कृति प्रणाली के विकास की उपंयास तकनीक पर रिपोर्ट । मॉडल लागत कुशल, आसानी से विश्लेषण किया जा करने में सक्षम है, और कई डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों है । विशेष रूप से, हम माउस ehbd अलगाव और एकल कोशिका वियोजन, अंगाभ संस्कृति दीक्षा, प्रचार, और दीर्घकालिक रखरखाव और भंडारण की पद्धति का वर्णन । इस पांडुलिपि में इम्युनोहिस्टोकेमिस्ट्री, फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के लिए EHBDO प्रोसेसिंग, और रियल-टाइम क्वांटिटेटिव रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पोलीमरेज चेन रिएक्शन (क्यूआरटी-पीसीआर) द्वारा एमआरएनए प्रचुरता के बारे में भी बताया गया है । इस प्रोटोकॉल में EHBD-विशिष् ट ऑर्गेनॉइड उत् पन् न करने के अतिरिक् त महत् वपूर्ण लाभ हैं एल-WRN कोशिकाओं से एक वातानुकूलित माध्यम का उपयोग काफी इस मॉडल की लागत कम कर देता है । माउस EHBDs का उपयोग संस्कृति पीढ़ी के लिए मानव ऊतक के विपरीत, लगभग असीमित ऊतक प्रदान करता है । उत्पन्न माउस EHBDOs अंतर्त्वचीय जनक और विभेदक पित्त कोशिकाओं के मार्कर के साथ उपकला कोशिकाओं की एक शुद्ध जनसंख्या होते हैं । संवर्धित ऑर्गेनॉइड कई मार्ग के माध्यम से समरूप आकारिकी बनाए रखते हैं और तरल नाइट्रोजन में एक दीर्घकालिक भंडारण अवधि के बाद पुनर्प्राप्त किया जा सकता है । मॉडल पित्त जनक सेल प्रसार के अध्ययन के लिए अनुमति देता है, औषधीय हेरफेर किया जा सकता है, और आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहों से उत्पंन किया जा सकता है । भविष्य के अध्ययन आदेश चढ़ाना दक्षता बढ़ाने के लिए, कार्यात्मक सेल परिपक्वता का मूल्यांकन करने के लिए संस्कृति की स्थिति का अनुकूलन करने की जरूरत है, और सीधे कोशिका भेदभाव । सह-संस्कृति मॉडलों का विकास और अधिक जैविक रूप से तटस्थ बाह्य-कोशिकीय मैट्रिक्स भी वांछनीय है ।
कोलेंगियोपैथी लाइलाज जीर्ण प्रगतिशील विकार है कि पित्त कोशिकाओं को प्रभावित अंतर और प्रत्यययकृत पित्त नलिकाओं (EHBDs)1में स्थित हैं । कुछ cholangiopathies प्राथमिक स्कलेरोसिंग चोलवाहिनीशोथ, cholangiopathies, पित्त अविवरता, और choledoंचल अल्सर की तरह, मुख्य रूप से EHBDs को प्रभावित करते हैं । Cholangiopathies के लिए चिकित्सा के विकास के पूर्व नैदानिक मॉडलों की सीमित उपलब्धता द्वारा प्रतिबंधित है । इसके अलावा, पिछले अध्ययनों में एक साथ समूहीकृत cholangiopathies पर ध्यान केंद्रित: जिगर, इंट्रा, और EHBDs । हालांकि, इंट्रा और EHBDs एक अलग भ्रूण मूल है और इस प्रकार, अलग आणविक विकृतियों के रूप में माना जाना चाहिए । Intrahepatic पित्त नलिकाओं और यकृत अंधवर्धी के कपाल भाग से विकसित, पूरी ehbds यकृत अंधवर्ध2के पुच्छीय भाग से विकसित । वे भी वयस्क homeostasis के लिए विभिंन प्रजनक कोशिका डिब्बों पर निर्भर, अंतःयकृत पित्त नलिकाओं और ehbds2,3में periपित्त ग्रंथियों में hering के नहरों सहित । पूर्व नैदानिक अध्ययन के लिए पशु मॉडलों का उपयोग खर्च द्वारा सीमित है और नैतिक कारणों के लिए कम किया जाना चाहिए । इसलिए, reductionist, reproducible, समय और लागत कुशल इन विट्रो मॉडल बहुत वांछनीय हैं ।
अधिकांश पूर्व अध्ययन के cholangiopathies सामान्य माउस या चूहे के कैंसर के मॉडल का उपयोग किया, या मानव cholangiopathies सेल लाइनों intra और ehbds4,5,6,7से व्युत्पन्न. हालांकि, इन रूपांतरित कोशिकाओं के मॉडल हैं और सामान्य cholangiocyte जीव विज्ञान homeostasis में या एक स्वस्थ राज्य में फिर से करना नहीं है । Organotypic संस्कृति मॉडल के विकास में हाल ही में प्रगति विभिन्न ऊतक प्रकार से 3 आयामी संरचनाओं के विकास की अनुमति दी है, hepatobilliऊतकों सहित, हालांकि नहीं सामान्य माउस ehbds8,9, १०। ये “अंग की तरह” संरचनाओं प्राथमिक ऊतक नकल उतार के उद्देश्य से और एक कृत्रिम जगह में बड़े हो रहे हैं आत्म समर्थन अंग के नवीकरण-विशिष्ट स्टेम/
“Organoid” एक व्यापक शब्द है कि सबसे अधिक 3 आयामी ऊतक स्टेम सेल से व्युत्पंन मॉडल का वर्णन है । ऑर्गेनॉइड भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं और प्रेरित pluripotent स्टेम सेल द्वारा प्रतिनिधित्व reprogrammed pluripotent स्टेम कोशिकाओं से उत्पंन किया जा सकता है । वे भी अंग विशिष्ट वयस्क स्टेम सेल से उत्पंन किया जा सकता है12। पिछले शोध अध्ययनों में कुछ कोलेंगियोसाइट ऑर्गेनॉइड मॉडलों का प्रस्ताव किया गया है । इस प्रकार, मानव pluripotent स्टेम सेल से व्युत्पंन ऑर्गेनॉयड7,9,13 की सूचना दी गई है और एक मूल्यवान, समय कुशल उपकरण है कि विभिंन प्रकार के सेल के एक साथ पीढ़ी के लिए अनुमति देता है प्रदान करते हैं । हालांकि, इन pluripotent स्टेम सेल व्युत्पंन organoids पूरी तरह से संरचना और प्राथमिक वयस्क EHBD cholangiocytes की कार्यक्षमता को प्रतिबिंबित नहीं करते ।
ह्यूमन9 और फेलीन10 लिवर की एडल्ट स्टेम सेल से व्युत्पन्न ऑर्गेनॉयड भी प्रस्तावित किया गया । Feline मॉडल व्यापक रूप से उपलब्ध नहीं है और अध्ययन के प्रयोजनों के लिए सीमित उपकरण armamentarium है । इसके अलावा, इन यकृत प्राप्त वयस्क स्टेम सेल व्युत्पंन ऑर्गेनॉइड न मॉडल प्रत्यययकृत cholangiocytes बल्कि अंतःयकृत cholangiocytes ।
मानव सामान्य Ehbd14 और माउस ehbd cholangiocarcinoma15से ehbd ऑर्गेनॉइड जनरेशन की सूचना दी गई थी । हालांकि, मानव EHBD ऊतक के लिए उपयोग बहुत सीमित है, और organoids cholangiocarcinoma के एक आनुवंशिक murine मॉडल से व्युत्पंन15 homeostasis में स्वस्थ cholangiocyte जीव विज्ञान का प्रतिनिधित्व नहीं करते है और आनुवंशिक रूप से संशोधित कोशिकाओं से प्राप्त कर रहे हैं ।
Pluripotent स्टेम सेल की सीमाओं को संबोधित करने के लिए-और जिगर से व्युत्पन्न कोलीनाओसाइट अंगाभ मॉडल और पूर्व नैदानिक मॉडलों में आवश्यक मानव ऊतकों के लिए सीमित पहुँच, हम एक murine ehbd आर्गेनोइड मॉडल विकसित (चित्र 1ए). इस पांडुलिपि माउस EHBD के लिए एक तकनीक के विकास का वर्णन-वयस्क ऊतक से organoids व्युत्पंन । EHBDOs नाम के ये EHBD ऑर्गेनॉयड इन विट्रो टूल के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण होगा, जो Ehbd कोलेनिओनाइट होमियोसाइट और रोग प्रक्रियाओं, जैसे कि कोलीवाहियोपैथी के रूप में अंतर्निहित है ।
यह काम माउस EHBD cholangiocytes के एक organotypic 3 आयामी मॉडल की पीढ़ी का वर्णन । EHBDO संस्कृति उत्पादन में महत्वपूर्ण कदम सावधानी EHBDO विच्छेदन शामिल करने के लिए अग्ंयाशय सेल संदूषण से बचने के लिए, बाँझ शर्तों के रखरखाव बैक्ट?…
The authors have nothing to disclose.
इस काम के लिए अमेरिकन एसोसिएशन द्वारा जिगर रोग शिखर पुरस्कार के अध्ययन के लिए समर्थन किया गया (एन. आर.) और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान, राष्ट्रीय मधुमेह और पाचन और गुर्दे की बीमारियों के संस्थान (पुरस्कार P30 DK34933 एन. आर., P01 DK062041 से J.L.M.). हम इस पद्धति के विकास के साथ उनकी सहायता के लिए डॉ रेमन Ocadiz-Ruiz (मिशिगन विश्वविद्यालय) धंयवाद ।
L-WRN cell culture medium | |||
Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | 1% | Life Technologies | 10437-028 |
Penicillin-Streptomycin | 100 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
Washing buffer | |||
Phosphate Buffered Saline (PBS) | 50 mL | Life Technologies | 10010-023 |
Penicillin-Streptomycin | 125 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
Amphotericin B | 6.25 µg/mL | Life Technologies | 15290-018 |
Organoid culture medium | |||
L-WRN Conditioned medium | 1:1 | ATCC | CRL-3276 |
Advanced DMEM/F12 | 1:1 | Life Technologies | 12634-010 |
Penicillin-Streptomycin | 100 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
N-Glutamine | 10 µl/mL | Life Technologies | 35050-061 |
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid, HEPES | 10 mM | Life Technologies | 15630-080 |
B27 | 10 µl/mL | Gibco | 17504-044 |
N2 | 10 µl/mL | Gibco | 17502-048 |
Organoid seeding medium | |||
Organoid culture medium | |||
Epidermal growth factor (EGF) | 50 ng/mL | Invitrogen | PMG8041 |
Fibroblast growth factor-10 (FGF10) | 100 ng/mL | PeproTech | 100-26 |
Primary antibodies | |||
Anti-Cytokeratin 19 (CK19) antibody, Rabbit | 1:250 | Abcam | ab53119 |
Sex-Determining Region Y-Box 9 (SOX9) antibody, Rabbit | 1:200 | Santa Cruz | sc-20095 |
Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX1) antibody, Rabbit | 1:2000 | DSRB | F109-D12 |
E-cadherin antibody, Goat | 1:500 | Santa Cruz | sc-31020 |
Acetylated α-tubulin antibody, Mouse | 1:500 | Sigma-Aldrich | T6793 |
Secondary antibodies | |||
488 labeled anti-rabbit, Donkey IgG | 1:1000 | Invitrogen | A-21206 |
594 labeled anti-goat, Donkey IgG | 1:1000 | Invitrogen | A-11058 |
568 labeled anti-mouse, Goat IgG2b | 1:500 | Invitrogen | A-21144 |
TopFlash Wnt reporter assay | |||
TopFlash HEK293 cell line | ATCC | CRL-1573 | |
Luciferase Assay Kit | Biotium | 30003-2 | |
0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
0.4% Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15250061 | |
Additional materials and reagents | |||
Basement matrix, phenol free Matrigel | CORNING | 356237 | |
Dissociation buffer, Accutase | Gibco | A1110501 | |
Cell culture freezing medium, Recovery | Life Technologies | 12648010 | |
Cell strainer (70 µm, steriled) | Fisherbrand | 22363548 | |
Guanidinium thiocyanate-phenol RNA extraction, TRIzol | Invitrogen | 15596026 | |
Specimen processing gel, HistoGel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | |
Universal mycoplasma detection kit | ATCC | 30-1012K | |
1.5 mL microcentrifuge tube | Fisherbrand | 05-408-129 | |
24 well plate | USA Scientific | CC7682-7524 | |
50 mL conical centrifuge tube | Fisher scientific | 14-432-22 | |
Fluorescence microscope | Nikon | Eclipse E800 | |
Inverted microscope | Biotium | 30003-2 | |
Necropsy tray | Fisherbrand | 13-814-61 |