Generasjon av Organoids fra mus Extrahepatic galle kanaler
Summary
Denne protokollen beskriver produksjon av en mus extrahepatic galle duct 3-dimensjonale organoid system. Disse biliær organoids kan vedlikeholdes i kultur å studere cholangiocyte biologi. Biliær organoids express markører for både stamfar og biliær celler og består av polarisert epitelceller.
Abstract
Cholangiopathies, som påvirker extrahepatic galle kanaler (EHBDs), inkluderer biliær atresia, primær skleroserende kolangitt og cholangiocarcinoma. De har ingen effektiv behandlingsalternativer. Verktøy for å studere EHBD er svært begrenset. Vårt formål var å utvikle en organ-spesifikke, allsidig, voksen Stamcelle-avledet, preklinisk cholangiocyte modell som lett kan genereres fra vill type og genmodifiserte mus. Derfor rapportere vi om teknikken for å utvikle en EHBD organoid (EHBDO) kultur-systemet fra voksen mus EHBDs. Modellen er kostnadseffektiv, kunne analyseres lett, og har flere nedstrøms programmer. Spesielt beskrive vi metodikk musen EHBD isolasjon og enkelt celle dissosiasjon, organoid kultur innvielsen, overføring, og langsiktig vedlikehold og lagring. Dette manuskriptet beskriver også EHBDO behandling for immunohistochemistry og fluorescerende mikroskopi mRNA overflod kvantifisering av sanntids kvantitative omvendt transkripsjon polymerasekjedereaksjons (qRT-PCR). Denne protokollen har betydelige fordeler i tillegg til å produsere EHBD-spesifikke organoids. Bruk av et betinget medium fra L-ADV celler reduserer kostnadene for denne modellen. Bruk av mus EHBDs gir nesten ubegrensede vev kultur generasjon, i motsetning til menneskelig vev. Genererte musen EHBDOs inneholder rene innbyggere epitelceller med markører for endodermal stamfar og differensiert biliær celler. Kultivert organoids opprettholde homogen morfologi gjennom flere passasjer og kan gjenopprettes etter en langsiktig lagringsperiode i flytende nitrogen. Modellen muliggjør studiet av biliær stamfar celle spredning, kan manipuleres farmakologisk, og kan genereres fra genmodifiserte mus. Fremtidige studier for å optimere oppdrettsforholdene for å øke plating effektivitet, evaluere funksjonelle celle modenhet og direkte celledifferensiering. Utvikling av co kultur modeller og en mer biologisk nøytral ekstracellulær matrix er også ønskelig.
Introduction
Cholangiopathies er uhelbredelig kronisk progressiv lidelser som påvirker biliær celler i intra- og extrahepatic biliær kanaler (EHBDs)1. Noen cholangiopathies, som primær skleroserende kolangitt, cholangiocarcinoma, biliær atresia og choledochal cyster, påvirker hovedsakelig EHBDs. Utviklingen av terapi for cholangiopathies er begrenset av den begrensede tilgjengeligheten av prekliniske modeller. I tillegg tidligere studier fokuserte på cholangiopathies gruppert: leveren, intra- og EHBDs. Imidlertid intra- og EHBDs har en distinkt embryonale opprinnelse og dermed bør betraktes som ulike molekylær patologi. Intrahepatic galle kanaler utvikle fra intrahepatic ductal platene og kraniale del av hepatisk divertikkel, hele EHBDs utvikle fra caudal del av hepatisk divertikkel2. De er også avhengige av ulike stamfar celle rom for voksen homeostase, inkludert kanalene i Hering i intrahepatic galle kanaler og peribiliary kjertler i EHBDs2,3. Bruk av dyremodeller for prekliniske studier er begrenset av utgifter og bør minimaliseres etiske grunner. Derfor er reduksjonistisk, reproduserbare, tid og kostnadseffektiv i vitro modeller svært ettertraktet.
De fleste tidligere studier av cholangiopathies benyttet normal mus eller rotte kreft modeller, eller menneskelig cholangiocarcinoma cellelinjer intra – og EHBDs4,5,6,7. Men disse er modeller av transformert celler og er recapitulate ikke normal cholangiocyte biologi homeostase eller sunne. Framskritt i utviklingen av organotypic kultur modeller har tillatt utviklingen av 3-dimensjonale strukturer fra ulike vev typer, inkludert sykdommer i lever og vev, men ikke normal mus EHBDs8,9, 10. Disse “orgel-like” strukturer å etterligne primære vev og dyrkes i en kunstig nisje støtte selvtillit fornyelse organ-spesifikke stem/stamfar celler11.
“Organoid” er et bredt begrep som de fleste vanligvis beskriver 3-dimensjonale vev modeller Hentet fra stamceller. Organoids kan genereres fra omprogrammeres pluripotent stamceller representert av embryonale stamceller og indusert pluripotent stamceller. De kan også genereres fra organ-spesifikke voksen stilk celler12. Noen cholangiocyte organoid modeller har blitt foreslått i tidligere undersøkelser. Dermed organoids avledet fra menneskelige pluripotent stamceller har vært rapportert7,9,13 og gi en verdifull, tid effektivt verktøy som lar for samtidige generasjon av forskjellige celletyper. Men gjenspeiler disse pluripotent Stamcelle-avledet organoids ikke fullt strukturen og funksjonaliteten av primære voksen EHBD cholangiocytes.
Organoids stammer fra voksen stilk celler av menneskelig9 og feline10 leveren ble foreslått. Feline modeller er ikke allment tilgjengelig, og har begrenset verktøyet armamentarium for øyemed. Videre er modell ikke disse lever-avledet voksen Stamcelle-avledet organoids extrahepatic cholangiocytes men heller intrahepatic cholangiocytes.
EHBD organoid generasjon ble rapportert fra menneskelige normal EHBDs14 og mus EHBD cholangiocarcinoma15. Imidlertid tilgang til menneskelig EHBD vev er svært begrenset, og organoids fra en genetisk murine modell cholangiocarcinoma15 representerer ikke sunt cholangiocyte biologi ved homeostase og er avledet fra genetisk endret celler.
For å løse begrensningene for pluripotent stamceller – og lever-avledet cholangiocyte organoid modeller og begrenset tilgang til menneskelig vev behov i preklinisk modeller, utviklet vi en murine EHBD organoid modell (figur 1A). Dette manuskriptet beskriver utviklingen av en teknikk for mus EHBD-avledet organoids fra voksen vev. Disse EHBD organoids kalt EHBDOs vil være et viktig i vitro verktøy for studiet av mekanismene bak EHBDs cholangiocyte homeostase og sykdom prosesser, for eksempel cholangiopathies.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette verket beskriver generering av en organotypic 3-dimensjonal modell av musen EHBD cholangiocytes. Viktige skritt i EHBDO kultur generasjon inkluderer grundig EHBD disseksjon for å unngå bukspyttkjertelen celle forurensning, vedlikehold av sterile forhold å hindre bakterier og sopp forurensning og forsiktig manipulasjon etter sentrifugering å unngå det tap av mobilnettet materiale. En nær overholdelse beskrevet temperaturer kreves. Det er noen begrensninger med teknikken. EHBDs av voksen mus er små (ca 1 mm i …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av American Association for studie av lever sykdommer Pinnacle prisen (til N.R.) og National Institutes of Health, National Institute Diabetes og fordøyelsesenzymer og nyre sykdommer (priser P30 DK34933 til N.R., P01 DK062041 til J.L.M.). Vi takker Dr. Ramon Ocadiz-Ruiz (University of Michigan) for hans hjelp med utvikling av denne metoden.
Materials
| L-WRN cell culture medium | |||
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | 1% | Life Technologies | 10437-028 |
| Penicillin-Streptomycin | 100 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| Washing buffer | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | 50 mL | Life Technologies | 10010-023 |
| Penicillin-Streptomycin | 125 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| Amphotericin B | 6.25 µg/mL | Life Technologies | 15290-018 |
| Organoid culture medium | |||
| L-WRN Conditioned medium | 1:1 | ATCC | CRL-3276 |
| Advanced DMEM/F12 | 1:1 | Life Technologies | 12634-010 |
| Penicillin-Streptomycin | 100 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| N-Glutamine | 10 µl/mL | Life Technologies | 35050-061 |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid, HEPES | 10 mM | Life Technologies | 15630-080 |
| B27 | 10 µl/mL | Gibco | 17504-044 |
| N2 | 10 µl/mL | Gibco | 17502-048 |
| Organoid seeding medium | |||
| Organoid culture medium | |||
| Epidermal growth factor (EGF) | 50 ng/mL | Invitrogen | PMG8041 |
| Fibroblast growth factor-10 (FGF10) | 100 ng/mL | PeproTech | 100-26 |
| Primary antibodies | |||
| Anti-Cytokeratin 19 (CK19) antibody, Rabbit | 1:250 | Abcam | ab53119 |
| Sex-Determining Region Y-Box 9 (SOX9) antibody, Rabbit | 1:200 | Santa Cruz | sc-20095 |
| Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX1) antibody, Rabbit | 1:2000 | DSRB | F109-D12 |
| E-cadherin antibody, Goat | 1:500 | Santa Cruz | sc-31020 |
| Acetylated α-tubulin antibody, Mouse | 1:500 | Sigma-Aldrich | T6793 |
| Secondary antibodies | |||
| 488 labeled anti-rabbit, Donkey IgG | 1:1000 | Invitrogen | A-21206 |
| 594 labeled anti-goat, Donkey IgG | 1:1000 | Invitrogen | A-11058 |
| 568 labeled anti-mouse, Goat IgG2b | 1:500 | Invitrogen | A-21144 |
| TopFlash Wnt reporter assay | |||
| TopFlash HEK293 cell line | ATCC | CRL-1573 | |
| Luciferase Assay Kit | Biotium | 30003-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| 0.4% Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15250061 | |
| Additional materials and reagents | |||
| Basement matrix, phenol free Matrigel | CORNING | 356237 | |
| Dissociation buffer, Accutase | Gibco | A1110501 | |
| Cell culture freezing medium, Recovery | Life Technologies | 12648010 | |
| Cell strainer (70 µm, steriled) | Fisherbrand | 22363548 | |
| Guanidinium thiocyanate-phenol RNA extraction, TRIzol | Invitrogen | 15596026 | |
| Specimen processing gel, HistoGel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | |
| Universal mycoplasma detection kit | ATCC | 30-1012K | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| 24 well plate | USA Scientific | CC7682-7524 | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Fisher scientific | 14-432-22 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | Eclipse E800 | |
| Inverted microscope | Biotium | 30003-2 | |
| Necropsy tray | Fisherbrand | 13-814-61 |
References
- Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F. The Cholangiopathies. Mayo Clinic Proceedings. 90 (6), 791-800 (2015).
- Carpino, G., et al. Stem/Progenitor Cell Niches Involved in Hepatic and Biliary Regeneration. Stem Cells International. 2016, 3658013 (2016).
- DiPaola, F., et al. Identification of intramural epithelial networks linked to peribiliary glands that express progenitor cell markers and proliferate after injury in mice. Hepatology. 58 (4), 1486-1496 (2013).
- Venter, J., et al. Development and functional characterization of extrahepatic cholangiocyte lines from normal rats. Digestive And Liver Disease. 47 (11), 964-972 (2015).
- Glaser, S. S., et al. Morphological and functional heterogeneity of the mouse intrahepatic biliary epithelium. Laboratry Investigation. 89 (4), 456-469 (2009).
- Cardinale, V., et al. Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets. Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).
- De Assuncao, T. M., et al. Development and characterization of human-induced pluripotent stem cell-derived cholangiocytes. Laboratry Investigation. 95 (6), 684-696 (2015).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Kruitwagen, H. S., et al. Long-Term Adult Feline Liver Organoid Cultures for Disease Modeling of Hepatic Steatosis. Stem Cell Reports. 8 (4), 822-830 (2017).
- Spence, J. R. Taming the Wild West of Organoids, Enteroids, and Mini-Guts. Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 5 (2), 159-160 (2018).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends In Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Sampaziotis, F. Building better bile ducts. Science. 359 (6380), 1113 (2018).
- Sampaziotis, F., et al. Reconstruction of the mouse extrahepatic biliary tree using primary human extrahepatic cholangiocyte organoids. Nature Medicine. 23 (8), 954-963 (2017).
- Nakagawa, H., et al. Biliary epithelial injury-induced regenerative response by IL-33 promotes cholangiocarcinogenesis from peribiliary glands. Proceedings Of The Natural Academy Of Science Of The United States Of America. 114 (19), E3806-E3815 (2017).
- Razumilava, N. Hedgehog signaling modulates IL-33-dependent extrahepatic bile duct cell proliferation in mice. Hepatology Communications. , (2018).
- Boyer, J. L. Bile formation and secretion. Comprehensive Physiology. 3 (3), 1035-1078 (2013).
- Carpino, G., et al. Biliary tree stem/progenitor cells in glands of extrahepatic and intraheptic bile ducts: an anatomical in situ study yielding evidence of maturational lineages. Journal Of Anatomy. 220 (2), 186-199 (2012).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Williamson, I. A., et al. A High-Throughput Organoid Microinjection Platform to Study Gastrointestinal Microbiota and Luminal Physiology. Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).
- Wan, A. C. A. Recapitulating Cell-Cell Interactions for Organoid Construction – Are Biomaterials Dispensable?. Trends In Biotechnology. 34 (9), 711-721 (2016).
