Generation av Organoids från mus extrahepatiska gallgångarna
Summary
Det här protokollet beskriver produktionen av en mus extrahepatiska gallvägar 3-dimensionell organoid system. Dessa biliär organoids kan upprätthållas i kulturen att studera cholangiocyte biologi. Gallan organoids express markörer både stamceller och biliär celler och består av polariserade epitelceller.
Abstract
Cholangiopathies, som påverkar extrahepatiska gallgångarna (EHBDs), inkluderar biliär atresi, primär skleroserande kolangit och cholangiocarcinoma. De har inga effektiva behandlingsalternativ. Verktyg för att studera EHBD är mycket begränsade. Vårt syfte var att utveckla en organ-specifika, mångsidig, vuxna stamceller-derived, preklinisk cholangiocyte modell som enkelt kan genereras från vildtyp och genetiskt modifierade möss. Således rapportera vi om roman tekniken för att utveckla ett EHBD organoid (EHBDO) kultur system från vuxen mus EHBDs. Modellen är kostnadseffektiva, kunna analyseras lätt, och har flera nedströms tillämpningar. Specifikt, beskriver vi metodiken av mus EHBD isolering och enda cell dissociation, organoid kultur initiering, förökning, och långsiktigt underhåll och lagring. Detta manuskript beskriver också EHBDO bearbetning för immunohistokemi, fluorescerande Mikroskopi och mRNA överflöd kvantitering av realtid kvantitativa omvänd transkription polymeras-kedjereaktion (qRT-PCR). Detta protokoll har betydande fördelar förutom att producera EHBD-specifika organoids. Användning av en betingad medium från L-VARN celler minskar kostnaden för denna modell. Användningen av musen EHBDs ger nästan obegränsad vävnad för kultur generation, till skillnad från mänsklig vävnad. Genererade mus EHBDOs innehåller en ren population av epitelceller med markörer för endodermal stamceller och differentierade biliär celler. Odlade organoids upprätthålla homogen morfologi genom flera passager och kan återställas efter en långvarig lagringstid i flytande kväve. Modellen möjliggör studiet av biliär progenitor cell spridning, kan manipuleras farmakologiskt och kan genereras från genetiskt modifierade möss. Framtida studier behövs för att optimera odlingsbetingelserna för att öka effektiviteten i bordläggningen, utvärdera funktionella cell mognad och direkta celldifferentiering. Utveckling av samarbete kultur modeller och en mer biologiskt neutrala extracellulärmatrix är också önskvärt.
Introduction
Cholangiopathies är obotlig kronisk progressiv störningar som påverkar biliär celler ligger i intra- och extrahepatiska gallvägar kanaler (EHBDs)1. Vissa cholangiopathies, såsom primär skleroserande kolangit, cholangiocarcinoma, biliär atresi och choledochal cystor, påverkar huvudsakligen EHBDs. Utvecklingen av behandlingar för cholangiopathies begränsas av den begränsade tillgången på prekliniska modeller. Dessutom tidigare studier fokuserat på cholangiopathies grupperade: lever, intra- och EHBDs. Dock intra- och EHBDs har en distinkt embryonala ursprung och således anses vara distinkta molekylär patologier. Intrahepatisk gallgångarna utvecklas från intrahepatisk duktal plattorna och den kraniella delen av nedsatt divertikel, hela EHBDs utvecklas från den kaudala delen av nedsatt divertikel2. De förlitar sig också på olika progenitor cell fack för vuxna homeostas, inklusive kanalerna i Hering i intrahepatisk gallgångarna och peribiliary körtlar i EHBDs2,3. Användning av djurmodeller för prekliniska studier begränsas av bekostnad och bör minimeras av etiska skäl. Därför, reduktionistiska, reproducerbara, tids och kostnadseffektiva in vitro-modeller är mycket önskvärda.
De flesta tidigare studier av cholangiopathies utnyttjade normal mus eller råtta cancer modeller eller mänskliga cholangiocarcinoma cellinjer som härstammar från intra- och EHBDs4,5,6,7. Men dessa är modeller av celler och sammanfatta inte normala cholangiocyte biologi vid homeostas eller i felfritt tillstånd. Senaste framsteg i utvecklingen av organotypic kultur modeller har tillåtit utvecklingen av 3-dimensionella strukturer från olika vävnadstyper, inklusive hepatobiliära vävnader, även om inte normal mus EHBDs8,9, 10. Dessa ”orgel-liknande” strukturer som syftar till att härma primära vävnad och odlas i en konstgjord nisch stödja självförnyelse organ-specifika stamceller/stamceller celler11.
”Organoid” är en bred term som de flesta vanligen beskriver 3-dimensionell vävnad modeller härrör från stamceller. Organoids kan genereras från omprogrammerade pluripotenta stamceller representeras av embryonala stamceller och inducerade pluripotenta stamceller. De kan också genereras från organ-specifika stamceller12. Vissa cholangiocyte organoid modeller har föreslagits i tidigare studier. Således organoids som härrör från mänskliga pluripotenta stamceller har varit rapporterade7,9,13 och ge ett värdefullt, tid effektivt verktyg som möjliggör samtidig framställning av olika celltyper. Dock återspeglar dessa pluripotenta stamceller-derived organoids inte helt strukturen och funktionaliteten i primär vuxen EHBD cholangiocytes.
Organoids härrör från stamceller av mänskliga9 och felint10 lever föreslogs också. Feline modeller är inte allmänt tillgänglig och har begränsade verktyg Arsenal i studiesyfte. Dessutom dessa lever-derived vuxna stamceller-derived organoids inte modell extrahepatiska cholangiocytes men ganska intrahepatisk cholangiocytes.
EHBD organoid generation rapporterades från människans normala EHBDs14 och mus EHBD cholangiocarcinoma15. Men tillgång till mänsklig EHBD vävnad är mycket begränsad, och organoids som härrör från en genetisk murina modell av cholangiocarcinoma15 representerar inte friska cholangiocyte biologi vid homeostas och härrör från genetiskt modifierade celler.
För att lösa begränsningarna av pluripotenta stamceller – och lever-derived cholangiocyte organoid modeller och begränsad tillgång till mänskliga vävnader behövs i prekliniska modeller, utvecklat vi en murina EHBD organoid modell (figur 1A). Detta manuskript beskriver utvecklingen av en teknik för mus EHBD-derived organoids från adult vävnad. Dessa EHBD organoids med namnet EHBDOs blir en viktig in vitro-verktyg för att studera mekanismerna bakom EHBDs cholangiocyte homeostas och sjukdom processer, såsom cholangiopathies.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta arbete beskriver generationen av en organotypic 3-dimensionell modell av mus EHBD cholangiocytes. Viktiga steg i EHBDO kultur generation inkluderar noggranna EHBD dissekering för att undvika bukspottkörteln cell kontaminering, underhåll av sterila förhållanden att förhindra bakterie- och svampinfektioner förorening och försiktig manipulation efter centrifugeringen att undvika den förlust av cellulära material. Det krävs en nära anslutning till beskrivs temperaturförhållanden. Det finns vissa begränsn…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av American Association for den studie av levern sjukdomar Pinnacle award (till Norberg) och National Institutes of Health, nationella institutet för Diabetes och mag och njursjukdomar (awards P30 DK34933 till Norberg, P01 DK062041 till J.L.M.). Vi tackar Dr. Ramon Ocadiz-Ruiz (University of Michigan) för hans hjälp med utvecklingen av denna metod.
Materials
| L-WRN cell culture medium | |||
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | 1% | Life Technologies | 10437-028 |
| Penicillin-Streptomycin | 100 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| Washing buffer | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | 50 mL | Life Technologies | 10010-023 |
| Penicillin-Streptomycin | 125 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| Amphotericin B | 6.25 µg/mL | Life Technologies | 15290-018 |
| Organoid culture medium | |||
| L-WRN Conditioned medium | 1:1 | ATCC | CRL-3276 |
| Advanced DMEM/F12 | 1:1 | Life Technologies | 12634-010 |
| Penicillin-Streptomycin | 100 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| N-Glutamine | 10 µl/mL | Life Technologies | 35050-061 |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid, HEPES | 10 mM | Life Technologies | 15630-080 |
| B27 | 10 µl/mL | Gibco | 17504-044 |
| N2 | 10 µl/mL | Gibco | 17502-048 |
| Organoid seeding medium | |||
| Organoid culture medium | |||
| Epidermal growth factor (EGF) | 50 ng/mL | Invitrogen | PMG8041 |
| Fibroblast growth factor-10 (FGF10) | 100 ng/mL | PeproTech | 100-26 |
| Primary antibodies | |||
| Anti-Cytokeratin 19 (CK19) antibody, Rabbit | 1:250 | Abcam | ab53119 |
| Sex-Determining Region Y-Box 9 (SOX9) antibody, Rabbit | 1:200 | Santa Cruz | sc-20095 |
| Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX1) antibody, Rabbit | 1:2000 | DSRB | F109-D12 |
| E-cadherin antibody, Goat | 1:500 | Santa Cruz | sc-31020 |
| Acetylated α-tubulin antibody, Mouse | 1:500 | Sigma-Aldrich | T6793 |
| Secondary antibodies | |||
| 488 labeled anti-rabbit, Donkey IgG | 1:1000 | Invitrogen | A-21206 |
| 594 labeled anti-goat, Donkey IgG | 1:1000 | Invitrogen | A-11058 |
| 568 labeled anti-mouse, Goat IgG2b | 1:500 | Invitrogen | A-21144 |
| TopFlash Wnt reporter assay | |||
| TopFlash HEK293 cell line | ATCC | CRL-1573 | |
| Luciferase Assay Kit | Biotium | 30003-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| 0.4% Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15250061 | |
| Additional materials and reagents | |||
| Basement matrix, phenol free Matrigel | CORNING | 356237 | |
| Dissociation buffer, Accutase | Gibco | A1110501 | |
| Cell culture freezing medium, Recovery | Life Technologies | 12648010 | |
| Cell strainer (70 µm, steriled) | Fisherbrand | 22363548 | |
| Guanidinium thiocyanate-phenol RNA extraction, TRIzol | Invitrogen | 15596026 | |
| Specimen processing gel, HistoGel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | |
| Universal mycoplasma detection kit | ATCC | 30-1012K | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| 24 well plate | USA Scientific | CC7682-7524 | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Fisher scientific | 14-432-22 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | Eclipse E800 | |
| Inverted microscope | Biotium | 30003-2 | |
| Necropsy tray | Fisherbrand | 13-814-61 |
References
- Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F. The Cholangiopathies. Mayo Clinic Proceedings. 90 (6), 791-800 (2015).
- Carpino, G., et al. Stem/Progenitor Cell Niches Involved in Hepatic and Biliary Regeneration. Stem Cells International. 2016, 3658013 (2016).
- DiPaola, F., et al. Identification of intramural epithelial networks linked to peribiliary glands that express progenitor cell markers and proliferate after injury in mice. Hepatology. 58 (4), 1486-1496 (2013).
- Venter, J., et al. Development and functional characterization of extrahepatic cholangiocyte lines from normal rats. Digestive And Liver Disease. 47 (11), 964-972 (2015).
- Glaser, S. S., et al. Morphological and functional heterogeneity of the mouse intrahepatic biliary epithelium. Laboratry Investigation. 89 (4), 456-469 (2009).
- Cardinale, V., et al. Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets. Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).
- De Assuncao, T. M., et al. Development and characterization of human-induced pluripotent stem cell-derived cholangiocytes. Laboratry Investigation. 95 (6), 684-696 (2015).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Kruitwagen, H. S., et al. Long-Term Adult Feline Liver Organoid Cultures for Disease Modeling of Hepatic Steatosis. Stem Cell Reports. 8 (4), 822-830 (2017).
- Spence, J. R. Taming the Wild West of Organoids, Enteroids, and Mini-Guts. Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 5 (2), 159-160 (2018).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends In Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Sampaziotis, F. Building better bile ducts. Science. 359 (6380), 1113 (2018).
- Sampaziotis, F., et al. Reconstruction of the mouse extrahepatic biliary tree using primary human extrahepatic cholangiocyte organoids. Nature Medicine. 23 (8), 954-963 (2017).
- Nakagawa, H., et al. Biliary epithelial injury-induced regenerative response by IL-33 promotes cholangiocarcinogenesis from peribiliary glands. Proceedings Of The Natural Academy Of Science Of The United States Of America. 114 (19), E3806-E3815 (2017).
- Razumilava, N. Hedgehog signaling modulates IL-33-dependent extrahepatic bile duct cell proliferation in mice. Hepatology Communications. , (2018).
- Boyer, J. L. Bile formation and secretion. Comprehensive Physiology. 3 (3), 1035-1078 (2013).
- Carpino, G., et al. Biliary tree stem/progenitor cells in glands of extrahepatic and intraheptic bile ducts: an anatomical in situ study yielding evidence of maturational lineages. Journal Of Anatomy. 220 (2), 186-199 (2012).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Williamson, I. A., et al. A High-Throughput Organoid Microinjection Platform to Study Gastrointestinal Microbiota and Luminal Physiology. Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).
- Wan, A. C. A. Recapitulating Cell-Cell Interactions for Organoid Construction – Are Biomaterials Dispensable?. Trends In Biotechnology. 34 (9), 711-721 (2016).
