نموذج تأثير القشرية الخاضعة للرقابة لإصابة الدماغ الماوس مع زرع العلاجية من الخلايا العصبية المستمدة من الخلايا الجذعية المتعددة القوى التي يسببها الإنسان
Summary
يوضح هذا البروتوكول منهجيات نموذج الماوس لإصابة الدماغ الصادمة في الجمجمة المفتوحة وزرع الخلايا المستزرعة المتعددة القوى في الخلايا الجذعية المتعددة القوى في موقع الإصابة. كما يتم وصف الاختبارات السلوكية والأنسجة لنتائج هذه الإجراءات باختصار.
Abstract
إصابات الدماغ الصادمة (TBI) هي السبب الرئيسي للاعتلال والوفيات في جميع أنحاء العالم. علم الأمراض بسبب TBI يتطور من الإهانة الميكانيكية الأولية لعمليات الإصابة الثانوية، بما في ذلك المبرمج والالتهاب. وقد كان النمذجة الحيوانية قيمة في البحث عن آليات الإصابة وتقييم العلاجات العصبية الوقائية المحتملة. يصف هذا البروتوكول نموذج التأثير القشري الخاضع للرقابة (CCI) لـ TBI البؤري المفتوح الرأس. وعلى وجه التحديد، يتم وصف المعلمات لإنتاج إصابة القشرية من جانب واحد خفيفة. يتم تحليل العواقب السلوكية للغرفة باستخدام اختبار إزالة شريط لاصق من التكامل الحسي الثنائي. فيما يتعلق بالعلاج التجريبي لعلم الأمراض TBI، يوضح هذا البروتوكول أيضا عملية لزرع الخلايا المستزرعة في الدماغ. تم اختيار ثقافات الخلايا العصبية المستمدة من الخلايا الجذعية متعددة القوى التي يسببها الإنسان (hiPSCs) لقدرتها على إظهار استعادة وظيفية متفوقة في المرضى TBI الإنسان. يتم الكشف عن البقاء على قيد الحياة المزمن من hiPSCs في أنسجة الدماغ الماوس المضيف باستخدام عملية المناعة DAB المعدلة.
Introduction
إصابة الدماغ الصادمة (TBI) هو مصطلح عام للإصابة المكتسبة في الدماغ بسبب إما القوى الميكانيكية غير المباشرة (تسارع الدوران / التباطؤ أو العكس الانقلاب) من ضربات على الرأس أو ضرر مباشر من الأجسام أو موجات الانفجار. وقد قُدِّر أن هذه الظاهرة هي السبب في حوالي 9 في المائة من الوفيات في جميع أنحاء العالم، وقد لوحظت في ما يقدر بنحو 50 مليون حالة في السنة1و2. وقدر تقرير صدر في عام 2017 عن مراكز مكافحة الأمراض والوقاية منها أنه في عام 2013، كان هناك ما مجموعه 2.8 مليون زيارة ووفاة في المستشفيات بسبب TBI في الولايات المتحدة3. ولا يتم الإبلاغ عن العديد من التّبع السل الأكثر اعتدالاً كل عام. TBI خطيرة يمكن أن يؤدي إلى ضعف مدى الحياة من الإدراك، وظيفة المحرك، ونوعية الحياة عموما. عواقب TBI خفيفة، وخاصة المتكررة المتصلة بالرياضة TBI، وقد تمتقدير ها فقط في الآونة الأخيرة لآثارها الصحية الغادرة 4،5.
النمذجة قبل السريرية هو عنصر حيوي لتطوير رؤى ميكانيكية جديدة والعلاج التصالحية المحتملة لTBI. تأثير القشرية الخاضعة للرقابة (CCI) نموذج TBI هو نموذج مفتوح الرأس من إصابة كدمة ميكانيكية إلى القشرة. يمكن تعديل معلمات التأثير لإنتاج إصابات CCI التيتتراوح من خفيفة إلى شديدة 6. إصابات CCI هي مركز ية بدلا من نشرها، كما رأينا مع نماذج أخرى من الرأس المغلقة من TBI. ويمكن إجراء CCI للحث على إصابة من جانب واحد، بحيث القشرة التعارضية يمكن أن تكون بمثابة الخدمة المدنية المتخذة أساسا للمقارنة الداخلية. يوضح هذا البروتوكول خصائص CCI خفيفة لجزء من القشرة التي تشمل المناطق الحسية الجسدية الأولية والحركية. وقد تم اختيار هذه المنطقة القشرية لمشاركتها في السلوكيات الحسية الحركية التي يمكن للعديد من اختبارات السلوك الكشف عن العجز الناجم عن الإصابة7. يمكن الكشف عن التحسينات السلوكية بسبب التدخلات العلاجية لTBI، وكذلك.
ومن السمات المميزة لـ TBI الخلل العصبي الواسع الانتشار في المنطقة المصابة. الخلايا العصبية المصابة تخضع لوفاة الخلية، ويتم تعطيل اتصال شبكة الخلايا العصبية8،9. TBI يعطل تجنيد الخلايا الجذعية الذاتية، مما يؤدي إلى مزيد من العجز السلوك المصب10،11. وقد تم استكشاف زرع الخلايا الجذعية العصبية والخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا كإمكانية لاستعادة وظيفة في الدماغ المصاب. بالإضافة إلى إمكانية استعادة الدوائر العصبية التالفة، الخلايا المزروعة ممارسة آثار الباراكرين التي تعزز بقاء الخلايا العصبية والانتعاش الوظيفي من TBI12. وقد تم زرع مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا قبل السريرية لتقييم إمكاناتها التصالحية في نماذج من الاضطرابات العصبية13،14،15. وقد أدى تعميم تكنولوجيا الخلايا الجذعية المتعددة القوى المستحثة16 في الآونة الأخيرة إلى تيسير تطوير العديد من خطوط الخلايا الجذعية البشرية للاستخدام التجريبي. اختبار ما قبل السريرية مع الخلايا المشتقة hiPSC هو خطوة أولى هامة لوصف فعالية خط خلية معينة العلاجية المحتملة ضد الأمراض البشرية. وقد وضع هذا المختبر بروتوكولات للتمييز hiPSCs إلى الأنماط الظاهرية العصبية17 سعيا وراء الخلايا القابلة للزرع للمساعدة في الانتعاش من إصابات الدماغ الصادمة.
التجارب في هذا البروتوكول استخدام CCI من جانب واحد للحث TBI إلى القشرة الحسية الجسدية اليسرى والحركية للفئران البالغة. إصابة CCI خفيفة يؤدي إلى عجز وظيفي مستمر في الصدارة اليمنى التي تستخدم لتتبع آثار الطعوم الخلية العصبية المستمدة من hiPSC على الانتعاش الوظيفي. تم تكييف اختبار الـ Forepaw sensorimotor في هذا البروتوكول من المنهجية التي وضعها بويت وزملاؤه18 وأثبتها سابقا فليمينغ وزملاؤه19. يحدد هذا البروتوكول سير عمل كامل لإجراء إصابة الدماغ التجريبية، وزرع العلاجية من خلايا hiPS، والتحليل السلوكي والأنسجة من مقاييس النتائج التجريبية.
Protocol
Representative Results
Discussion
CCI خفيفة كنظام نموذجي لاختبار العلاج التجديدي التجريبي
نموذج CCI هو أداة قيمة للتحقيق في آليات اختلال وظائف الأنسجة بعد الإصابة الميكانيكية في القشرة. قابلية المعلمات الإصابة هي سمة جذابة من هذا النموذج. تغيير عمق Z من التأثير، وسرعة، أو وقت يسكن يمكن أن تزيد أو تقلل من شدة الإصاب…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل بمنحة من مركز علم الأعصاب والطب التجديدي (CNRM، رقم المنحة G170244014). ونحن نقدر مساعدة ماهيما ديوان وكلارا سيلبريد في الدراسات التجريبية إزالة لاصقة. أجرى كريسلين رادومسكي إصابات أولية في الدماغ وعمليات زرع خلايا. قدمت أماندا فو ولورا تاكر من مختبر الدراسات الأساسية للدراسات ما قبل السريرية في جامعة الولايات المتحدة الوطنية للدراسات ما قبل السريرية نصائح قيمة حول العمليات الجراحية الحيوانية واختبار السلوك، على التوالي.
Materials
| 1 ml syringes | Becton Dickinson (BD) | 309659 | |
| 1.7 ml flip top test tubes | Denville | C2170 | |
| 10 microliter syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| 25G Precision Glide syringe needles | Becton Dickinson (BD) | 305122 | |
| 70% ethanol | Product of choice; varies by region | ||
| acetaminophen oral suspension | Tylenol (Children's) | Dilute to 1 mg/ml in water | |
| anesthetic vaporizer | Vetland | 521-11-22 | |
| animal handling cloth | Purchase from department store | ||
| Betadine | Purdue Products | NDC-67618-151-32 | |
| compressed oxygen | Product of choice; varies by region | ||
| cyclosporine A | Sigma-Aldrich | 30024-100mg | |
| DAB staining kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418-500ml | |
| DMEM | Invitrogen (ThermoFisher) | A14430-01 | |
| donkey anti-mouse IgG antibody, HRP conjugated | Jackson ImmunoResearch | 715-035-151 | |
| electrical tape | 3M Corporation | Purchase from department store | |
| fine tweezers | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| glass capillary pipettes, 1 mm OD, 0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100F-3 | |
| High Speed Rotary Micromotor Kit | Foredom Electric Co. | K.1070 – K.107018 | |
| Ideal Micro Drill Burr Set Of 5 | Cell Point Scientific | 60-1000 | |
| Impact One Stereotaxic Impactor for CCI | Leica Biosystems | 39463920 | |
| isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-60 | |
| lab bench timers | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Micropipette puller | MicroData Instruments, Inc. | PMP-102 | Any puller will suffice |
| Microscope cover slips | Fisherbrand | 12-545-E | |
| Microscope slide mounting medium | Product of choice | ||
| mirror | Purchase from department store | ||
| mouse anti-human nuclear antigen antibody | Millipore | MAB1281 | |
| Mouse on Mouse blocking kit | Vector Laboratories | BMK-2202 | |
| needle holder hemostat | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| ophthalmic ointment | Falcon Pharmaceuticals | NDC-61314-631-36 | |
| ophthalmic spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| plastic box | Purchase from department store | ||
| plastic cylinder | Purchase from department store | ||
| QSI motorized syringe pump | Stoelting | 53311 | |
| Removable needle compression fitting | Hamilton | 55750-01 | |
| small rodent stereotaxic frame | Stoelting | 51925 | |
| small scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| StemPro Accutase | Invitrogen (ThermoFisher) | A1110501 | |
| Sterile alcohol prep pads | Fisherbrand | 06-669-62 | |
| sterile cotton swabs/Kendall Q-tips | Tyco Healthcare | 540500 | |
| Sterile saline | Hospira | NDC-0409-1966-07 | |
| Stopwatches (2) | Fisher Scientific | 06-662-56 | |
| Superfrost Plus Gold microscope slides | Fisherbrand | 15-188-48 | |
| sutures – 5.0 silk with curved needle | Oasis | MV-682 |
References
- Maas, A. I. R., et al. Traumatic brain injury: integrated approaches to improve prevention, clinical care, and research. The Lancet Neurology. 16, 987-1048 (2017).
- Murray, C. J., et al. Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. The Lancet. 380, 2197-2223 (2012).
- Taylor, C. A., Bell, J. M., Breiding, M. J., Xu, L. Traumatic Brain Injury-Related Emergency Department Visits, Hospitalizations, and Deaths – United States, 2007 and 2013. Morbidity and mortality weekly report: Surveillance summaries. 66, 1-16 (2017).
- Fehily, B., Fitzgerald, M. Repeated Mild Traumatic Brain Injury: Potential Mechanisms of Damage. Cell Transplantation. 26, 1131-1155 (2017).
- Kulbe, J. R., Hall, E. D. Chronic traumatic encephalopathy-integration of canonical traumatic brain injury secondary injury mechanisms with tau pathology. Progress in Neurobiology. 158, 15-44 (2017).
- Romine, J., Gao, X., Chen, J. Controlled cortical impact model for traumatic brain injury. Journal of Visualized Experiments. , e51781 (2014).
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
- Mishra, A. M., et al. Decreased resting functional connectivity after traumatic brain injury in the rat. PloS ONE. 9, 95280 (2014).
- Sours, C., et al. Default mode network interference in mild traumatic brain injury – a pilot resting state study. Brain Research. 1537, 201-215 (2013).
- Radomski, K. L., Zhou, Q., Yi, K. J., Doughty, M. L. Cortical contusion injury disrupts olfactory bulb neurogenesis in adult mice. BMC Neuroscience. 14, 142 (2013).
- Wang, X., Gao, X., Michalski, S., Zhao, S., Chen, J. Traumatic Brain Injury Severity Affects Neurogenesis in Adult Mouse Hippocampus. Journal of Neurotrauma. 33, 721-733 (2016).
- Aertker, B. M., Bedi, S., Cox, C. S. Strategies for CNS repair following TBI. Experimental Neurology. 275 (3), 411-426 (2016).
- Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson’s disease model. Nature. 548, 592-596 (2017).
- Kondo, T., et al. Focal transplantation of human iPSC-derived glial-rich neural progenitors improves lifespan of ALS mice. Stem Cell Reports. 3, 242-249 (2014).
- Tong, L. M., et al. Inhibitory interneuron progenitor transplantation restores normal learning and memory in ApoE4 knock-in mice without or with Abeta accumulation. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34, 9506-9515 (2014).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Lischka, F. W., et al. Neonatal mouse cortical but not isogenic human astrocyte feeder layers enhance the functional maturation of induced pluripotent stem cell-derived neurons in culture. Glia. 66, 725-748 (2018).
- Bouet, V., et al. The adhesive removal test: a sensitive method to assess sensorimotor deficits in mice. Nature Protocols. 4, 1560-1564 (2009).
- Fleming, S. M., Ekhator, O. R., Ghisays, V. Assessment of sensorimotor function in mouse models of Parkinson’s disease. Journal of Visualized Experiments. , e50303 (2013).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. Compact 2nd edn. , (2004).
- Jacobs, G. H., Williams, G. A., Cahill, H., Nathans, J. Emergence of novel color vision in mice engineered to express a human cone photopigment. Science. 315, 1723-1725 (2007).
- Lundell, T. G., Zhou, Q., Doughty, M. L. Neurogenin1 expression in cell lineages of the cerebellar cortex in embryonic and postnatal mice. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 238, 3310-3325 (2009).
- Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment. Nature. 386, 493-495 (1997).
- Piltti, K. M., et al. Transplantation dose alters the dynamics of human neural stem cell engraftment, proliferation and migration after spinal cord injury. Stem Cell Research. 15, 341-353 (2015).
- Yu, S., et al. Severity of controlled cortical impact traumatic brain injury in rats and mice dictates degree of behavioral deficits. Brain Research. 1287, 157-163 (2009).
- Kabadi, S. V., Hilton, G. D., Stoica, B. A., Zapple, D. N., Faden, A. I. Fluid-percussion-induced traumatic brain injury model in rats. Nature Protocols. 5, 1552-1563 (2010).
- Namjoshi, D. R., et al. Defining the biomechanical and biological threshold of murine mild traumatic brain injury using CHIMERA (Closed Head Impact Model of Engineered Rotational Acceleration). Experimental Neurology. 292, 80-91 (2017).
- Shetty, A. K., Mishra, V., Kodali, M., Hattiangady, B. Blood brain barrier dysfunction and delayed neurological deficits in mild traumatic brain injury induced by blast shock waves. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 232 (2014).
- Petraglia, A. L., Dashnaw, M. L., Turner, R. C., Bailes, J. E. Models of mild traumatic brain injury: translation of physiological and anatomic injury. Neurosurgery. 75, 34-49 (2014).
- Siebold, L., Obenaus, A., Goyal, R. Criteria to define mild, moderate, and severe traumatic brain injury in the mouse controlled cortical impact model. Experimental Neurology. 310, 48-57 (2018).
- Tucker, L. B., Fu, A. H., McCabe, J. T. Performance of Male and Female C57BL/6J Mice on Motor and Cognitive Tasks Commonly Used in Pre-Clinical Traumatic Brain Injury Research. Journal of Neurotrauma. 33, 880-894 (2016).
- Rose, S. C., Fischer, A. N., Heyer, G. L. How long is too long? The lack of consensus regarding the post-concussion syndrome diagnosis. Brain Injury. 29, 798-803 (2015).
- Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nature Methods. 7, 825-826 (2010).
- Li, X., et al. Chronic behavioral testing after focal ischemia in the mouse: functional recovery and the effects of gender. Experimental Neurology. 187, 94-104 (2004).
- Andersen, A. B., Finger, S., Andersen, C. S., Hoagland, N. Sensorimotor cortical lesion effects and treatment with nimodipine. Physiology & Behavior. 47, 1045-1052 (1990).
- Al-Ali, H., et al. The mTOR Substrate S6 Kinase 1 (S6K1) Is a Negative Regulator of Axon Regeneration and a Potential Drug Target for Central Nervous System Injury. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 37, 7079-7095 (2017).
- Pleasant, J. M., et al. Rate of neurodegeneration in the mouse controlled cortical impact model is influenced by impactor tip shape: implications for mechanistic and therapeutic studies. Journal of Neurotrauma. 28, 2245-2262 (2011).
