Summary
Este protocolo demuestra metodologías para un modelo de ratón de lesión cerebral traumática de cráneo abierto y trasplante de células pluripotentes derivadas de células madre inducidas por el ser humano cultivadas en el sitio de la lesión. Las pruebas conductuales y histológicas de los resultados de estos procedimientos también se describen brevemente.
Abstract
La lesión cerebral traumática es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. La patología de la enfermedad debido a tAT progresa desde el insulto mecánico primario hasta los procesos de lesiones secundarias, incluyendo la apoptosis y la inflamación. El modelado animal ha sido valioso en la búsqueda para desentrañar los mecanismos de lesión y evaluar posibles terapias neuroprotectoras. Este protocolo describe el modelo de impacto cortical controlado (CCI) de TBI focal y de cabeza abierta. Específicamente, se describen los parámetros para producir una lesión cortical unilateral leve. Las consecuencias conductuales de CCI se analizan utilizando la prueba de eliminación de cinta adhesiva de la integración sensorimotor bilateral. En cuanto a la terapia experimental para la patología TBI, este protocolo también ilustra un proceso para trasplantar células cultivadas en el cerebro. Los cultivos celulares neuronales derivados de células madre pluripotentes inducidas por el hombre (hiPSC) fueron elegidos por su potencial para mostrar una restauración funcional superior en pacientes tBI humanos. La supervivencia crónica de los hiPSC en el tejido cerebral del ratón huésped se detecta mediante un proceso inmunohistoquímico DAB modificado.
Introduction
Lesión cerebral traumática (TBI) es un término general para la lesión adquirida en el cerebro debido a fuerzas mecánicas indirectas (aceleración/desaceleración rotacional o contragolpe) de golpes en la cabeza o daño directo de objetos o ondas explosivas. Se ha estimado que el TBI es la causa de aproximadamente el 9% de las muertes en todo el mundo y se ha observado en unos 50 millones de casos por año1,2. Un informe de 2017 de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades estimó que en 2013 hubo un total de 2,8 millones de visitas hospitalarias y muertes debidas a TBI en los Estados Unidos3. Muchos TMI más leves no se notifican cada año. El TBI grave puede conducir a un deterioro de por vida de la cognición, la función motora y la calidad de vida general. Las consecuencias de la TBI suave, especialmente tBI repetitivo relacionado con el deporte, han sido apreciadas recientemente por sus insidiosos efectos sobre la salud4,5.
El modelado preclínico es un componente vital del desarrollo de nuevos conocimientos mecanicistas y una posible terapia restauradora para la TBI. El modelo de impacto cortical controlado (CCI) de TBI es un modelo de cabeza abierta de lesión por contusión mecánica en la corteza. Los parámetros de impacto se pueden modificar para producir lesiones de CCI que van de leves a graves6. Las lesiones de CCI son focales más que difusas, como se ve con otros modelos de cabeza cerrada de TBI. EL CCI se puede realizar para inducir una lesión unilateral, de modo que la corteza contralateral puede servir como un comparador interno. Este protocolo demuestra las características de un CCI suave a una porción de la corteza que abarca las regiones primarias somatosensoriales y motoras. Esta área cortical fue elegida por su implicación en comportamientos sensorimotores para los cuales numerosas pruebas de comportamiento pueden detectar déficits inducidos por lesiones7. También se pueden detectar mejoras de comportamiento debidas a intervenciones terapéuticas para la TBI.
Una característica distintiva de la TBI es la disfunción neuronal generalizada en la región lesionada. Las neuronas lesionadas sufren muerte celular, y la conectividad de la red neuronal se interrumpe8,9. TBI interrumpe el reclutamiento de células madre endógenas, lo que conduce a mayores déficits de comportamiento aguas abajo10,11. El trasplante de células madre neurales y células derivadas de células madre se ha explorado como una posibilidad de restaurar la función en el cerebro lesionado. Además del potencial para restaurar los circuitos neuronales dañados, las células trasplantadas ejercen efectos paracrinos que promueven la supervivencia neuronal y la recuperación funcional de TBI12. Una variedad de tipos de células han sido trasplantados preclínicamente para evaluar su potencial restaurador en modelos de trastornos neurológicos13,14,15. La reciente popularización de la tecnología de células madre pluripotentes inducida16 ha facilitado el desarrollo de numerosas líneas de células madre humanas para uso experimental. Las pruebas preclínicas con células derivadas de hiPSC son un primer paso importante para caracterizar la eficacia terapéutica potencial de una línea celular dada contra enfermedades humanas. Este laboratorio ha desarrollado protocolos para diferenciar los hiPSC a los fenotipos neuronales17 en la búsqueda de células trasplantables para ayudar a la recuperación de lesiones cerebrales traumáticas.
Los experimentos en este protocolo utilizan un CCI unilateral para inducir TBI a la corteza somatosensorial y motora izquierda de ratones adultos. Una lesión leve de CCI resulta en un déficit funcional sostenido en la pata delantera derecha que se utiliza para realizar un seguimiento de los efectos del injerto de células neuronales derivado según la alta PSC en la recuperación funcional. Las pruebas de sensorimotor Forepaw en este protocolo se adaptaron a partir de la metodología establecida por Bouet y sus colegas18 y demostrada previamente por Fleming y sus colegas19. Este protocolo describe un flujo de trabajo completo para la realización de una lesión cerebral experimental, trasplante terapéutico de células hiPS y análisis conductual e histológico de las medidas de resultados experimentales.
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Protocol
Todos los experimentos descritos en este protocolo fueron revisados y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Servicios Uniformados.
1. Craniectomía e impacto cortical controlado
- Preparación del dispositivo de impacto cortical controlado y suministros quirúrgicos.
- Cargue una jeringa de punta deslizante de 1 ml con 0,5 ml de solución salina estéril para el riego de heridas. Coloque una aguja de 25 G en la jeringa para controlar el riego.
- Preparar una solución diluida de CsA en DMSO a la concentración final de 1 mg/ml. Cargue una segunda jeringa de punta deslizante de 1 ml con 0,5 ml de solución de ciclosporina A (CsA) para inmunosupresión. Coloque una aguja de 25 G o más grande en la jeringa CsA.
- Fije el pistón de impacto cortical controlado a un brazo en un marco estereotaxico y ajuste a un ángulo de 15o. Conecte una sonda impactador de 3 mm al pistón.
- Establezca la velocidad del impacto en 1,5 m/s y el tiempo de permanencia del impacto en 0,1 s para producir una lesión cortical leve.
- Realizar una craneectomía unilateral
- Coloque el ratón en una cámara de inducción de anestesia conectada a un vaporizador de isoflurano con fuente de oxígeno comprimido. Inducir la anestesia con isoflurano del 3% a 0,7 L/min de oxígeno. Compruebe la profundidad de la anestesia por la falta de respuesta al dedo del pie.
- Afeitar el cuero cabelludo con cortadoras eléctricas y limpiar cualquier pelaje suelto.
- Coloque el ratón en un marco estereotaxico con cono de nariz de entrega anestésica adjunto.
- Coloque una almohadilla de calentamiento a 37 oC en el marco estereotaxico debajo del ratón para mantener la temperatura corporal bajo anestesia. Fije la cabeza en su lugar con barras de oído y una barra de mordida y oriente la cabeza de tal manera que el hueso frontal del cráneo sea horizontal. Mantener la anestesia en el isoflurano de 1,5%-2% durante la duración de la cirugía.
- Para realizar cuidados preoperatorios y preparación quirúrgica aséptica, aplique pomada oftálmica antibiótica en los ojos utilizando un hisopo de algodón estéril. Aplique una solución a base de yodo en el área del cuero cabelludo afeitado. Retire esto con 70% de etanol. Cubra al animal con una cortina quirúrgica fenestrizada para que la parte superior de la cabeza sea visible pero los ojos estén cubiertos.
- Haga una incisión en la línea media (1,5-2 cm) en el cuero cabelludo con un bisturí o tijeras. Utilice hisopos de algodón estériles para limpiar la herida y limpiar la fascia izquierda de la línea media en bregma.
- Utilice la sonda del impactador para identificar el sitio de la craneectomía.
- Establezca el punto de referencia estereotaxico (X - 0, Y - 0) en bregma. Ajuste la sonda lateralmente a 2 mm a la izquierda de la línea media. Delinee un círculo de 5 mm de diámetro alrededor de la sonda utilizando un marcador de seguridad quirúrgica de punta fina. Levante y gire el impactador fuera de su posición.
- Utilice la herramienta manual del kit de micromotor rotativo de alta velocidad para hacer un agujero abierto en el cráneo usando una broca de punta redonda de 0,6 mm o 0,8 mm a una velocidad máxima de 0,6 mm o 0,8 mm a una velocidad máxima del 70% -80%. Aplique una ligera presión sobre el cráneo mientras perfora a lo largo del contorno circunferencial de 5 mm para adelgazar este borde.
- No aplique exceso de presión durante la perforación. Esto puede causar lesiones corticales debido a vibración, compresión o penetración accidental. Permita que la velocidad de la broca haga el trabajo.
- No perforar en un punto dado durante demasiado tiempo para evitar el exceso de calentamiento por fricción del cráneo. Irrigar la craniectomía ocasionalmente con solución salina estéril para eliminar los desechos y reducir el calentamiento de la herramienta rotativa.
- Preste mucha atención mientras perfora sobre la línea de sutura coronal, ya que estos puntos son vulnerables a la hemorragia.
- Usa un par de pinzas finas para extirpar el colgajo del cráneo cuando el contorno de la craneectomía esté lo suficientemente adelgazado. Sujete la solapa medially, y levante suavemente y tire lateralmente con un movimiento radial.
- No dañe la dura mater al levantar la solapa; esto puede causar lesiones graves y hemorragias.
- Realizar una lesión leve de impacto cortical controlado
- Limpie la sonda del impactador con una almohadilla de preparación de alcohol estéril. Vuelva a colocar la sonda impactador en su posición sobre la corteza expuesta. Baje la sonda hasta que toque la superficie dura mater. Marque esta posición como Z a 0.
- Retirar el pistón y pasar a Z -1,0 mm. Descargar el pistón para impactar la corteza.
- Levante rápidamente el pistón y mueva el brazo fuera de su posición. Aplicar cantidades generosas de salina para irrigar la corteza después de una lesión. Enjuague el sitio de la cirugía con salina según sea necesario y sutura la incisión del cuero cabelludo usando simples stiches interrumpidos con sutura de seda 5.0.
- Realizar cuidados postoperatorios en el ratón
- Suspenda la anestesia. Administrar CsA por inyección subcutánea en escruff a 10 mg/kg de dosis. Coloque el ratón en una jaula postoperatoria limpia y precalentada.
- Proporcionar analgésico paraparalaminofeno en el agua potable a 1,0 mg/ml.
NOTA: Proporcione analgesia de acuerdo con el procedimiento operativo estándar IACUC adecuado y teniendo en cuenta las variables de resultado experimentales (por ejemplo, sedación, neuroinflamación). - Proporcionar alimentos humedecidos de comida en una jaula de recuperación calentada para ayudar en la rehidratación y recuperación.
- Proceda de la sección 2 a la sección 4 anterior cuando realice controles solo de craneectomía (sham).
2. Trasplante estereotaxico de suspensión celular
- Comenzar el procedimiento de trasplante de células aproximadamente 24 h después de la craneectomía.
- Preparar el equipo de trasplante de células y los suministros quirúrgicos
- Llene una jeringa de punta deslizante de 1 ml con solución salina estéril para el riego de heridas. Coloque una aguja de 25 G en la jeringa para controlar el riego.
- Llene una jeringa de punta deslizante de 1 ml con solución DeCSA para inmunosupresión. Coloque una aguja de 25 G o más grande en la jeringa CsA. Rellene la jeringa CsA según sea necesario entre cirugías.
- Prepare agujas de vidrio a partir de pipetas capilares de vidrio borosilicato OD de 1,0 mm utilizando métodos estándar.
- Utilice pinzas finas para romper las puntas de las agujas a aproximadamente un diámetro de 200 m. Asegúrese de que el eje cilíndrico de la aguja no sea superior a 2,5 cm.
- Calibre la bomba de la jeringa para su uso con una jeringa de 10 ml. Introduzca un caudal de 0,2 l/min para entregar un volumen total de 2,0 l.
- Preparar la suspensión de células madre pluripotentes inducidas por el hombre (iPSC).
- Realice todo el manejo celular en un campana bSL-2 de cultivo celular utilizando técnicas de manejo estérilestándar estándar.
- Prepare los cultivos de celda de antemano de acuerdo con las condiciones estándar definidas para el tipo de celda. Refiera a Lischka et al.17 como ejemplo.
NOTA: Los experimentos mostrados en esta demostración utilizaron varias células de fenotipo neural derivadas de hiPSC. - Disocia suavemente las células en una suspensión de una sola célula usando una solución de desprendimiento de células, u otros medios enzimáticos o químicos preferidos.
- Cuente las células en suspensión, luego diluya la suspensión a 5 x 104 células / L en un medio de cultivo celular mínimo (por ejemplo, DMEM) en un tubo de prueba flip top de 1,7 ml.
- Tenga en cuenta las siguientes notas para el trasplante:
- Mantener las células en suspensión a 37 oC durante la duración de los procedimientos.
- Cargue la jeringa inmediatamente antes de realizar la inyección intraparenquimal (paso 4.5 a continuación).
NOTA: La gravedad puede hacer que la suspensión celular se asiente o se aferre al lado de la jeringa si se coloca de lado. Esto conduce a irregularidades en el número de células inyectadas. - Asignación de 5 x 105 células (suspensión de 10 l) por ratón si se realizan procedimientos de trasplante de varias células en un día.
- Realizar cirugía de trasplante estereotaxia
- Coloque el ratón en una cámara de inducción de anestesia conectada a un vaporizador de isoflurano con fuente de oxígeno comprimido. Inducir la anestesia con isoflurano del 3% a 0,7 L/min de oxígeno.
- Coloque el ratón en un marco estereono con cono de nariz anestésico conectado.
- Fije la cabeza en su lugar con barras de oído y una barra de mordida y oriente la cabeza de tal manera que el hueso frontal del cráneo sea horizontal. Mantener la anestesia en el isoflurano de 1,5%-2% durante la duración de la cirugía.
- Realizar cuidados preoperatorios y preparación aséptica
- Aplique pomada oftálmica hidratante que contenga antibióticos a los ojos con un hisopo de algodón.
- Lave el sitio de la incisión con solución salina estéril para limpiar el sitio y aflojar las suturas. Aplicar suavemente 70% de etanol con un hisopo de algodón para esterilizar el sitio de la incisión.
- Retire las suturas con pinzas finas y tijeras oftálmicas. Sitio de cirugía de irrigación y craniectomía con abundante solución salina estéril.
- Considere el animal para la exclusión si la corteza muestra características descalificativas incluyendo hernia excesiva, decoloración, vascularización alterada, o hemorragia.
- Cargue la jeringa de trasplante celular
- Mueva la suspensión celular de la incubadora de 37 oC a una campana de bioseguridad de cultivo celular. Gire suavemente o toque el tubo para asegurar una suspensión celular homogénea.
- Utilice un micro pipetador para cargar la suspensión celular de 7,5 l en la jeringa de Hamilton a través del extremo del émbolo.
- Sujete la jeringa en un ángulo de 120o con el extremo del émbolo hacia abajo. Inserte el émbolo, teniendo cuidado de no introducir una burbuja de aire entre la suspensión y la punta del émbolo.
- Fije el conjunto de la junta a la aguja de la pipeta y, a continuación, conecte la aguja a la jeringa.
- Empuje el émbolo para mover la suspensión celular en la aguja de la pipeta. Si hay resistencia contra la salida de la suspensión, utilice pinzas finas para romper la punta de la aguja para agrandar el diámetro.
- Conecte la jeringa a la bomba de jeringa estereotaxica. Avance el émbolo para asegurarse de que el conjunto de la bomba de la jeringa funciona correctamente.
- Mueva la aguja a las coordenadas para inyección.
- Alinee la punta de la aguja con bregma. Establezca las coordenadas X e Y en 0. A continuación, mueva la punta de la aguja sobre la craneectomía a 2,0 mm laterales y -1,0 mm posteriores a bregma. Toque la punta de la aguja en la superficie de dura mater y ajuste la coordenada estereotaxica a Z a 0.
- Empuje el émbolo para asegurarse de que la suspensión celular está fluyendo adecuadamente antes de introducir la aguja en el cerebro.
- Introducir la aguja en el cerebro a una profundidad de Z - -1,4 mm. Estas coordenadas estereoonócicas colocan el injerto en el borde gris de materia blanca de la corteza profunda20.
- Encienda la bomba de la jeringa para infundir la suspensión celular. Ajuste el temporizador del banco de laboratorio a 15 min e inicie el temporizador. Utilice un microscopio de larga distancia de trabajo para monitorear la salida de la suspensión celular.
- Irrigar el sitio de la cirugía con solución salina estéril durante la inyección para mantener la hidratación del tejido.
- A los 15 minutos, retire lentamente la aguja del trasplante. Irrigar el sitio de la cirugía con salina y cerrar la incisión con suturas.
- Realizar atención postoperatoria
- Suspenda la anestesia. Administrar CsA por inyección subcutánea en escruff a 10 mg/kg de dosis. Coloque el ratón en una jaula postoperatoria limpia y precalentada.
- Proporcionar analgésico paraparalaminofeno en el agua potable a 1,0 mg/ml.
NOTA: Proporcione analgesia de acuerdo con el protocolo de funcionamiento estándar (SOP) IACUC apropiado y teniendo en cuenta las variables de resultado experimentales. - Proporcionar jaula de recuperación de alimentos humedecidos para ayudar en la rehidratación y recuperación.
- Continúe las inyecciones diarias de CsA a 10 mg/kg durante la duración de supervivencia del ratón.
3. Prueba de eliminación de cinta adhesiva de integración sensorimotor
- Corte la cinta eléctrica en tiras de 3 mm x 5 mm con un pequeño cuchillo de afeitar antes de realizar la prueba de comportamiento. Utilice una superficie de vidrio lisa para cortar las tiras adhesivas.
NOTA: Utilice la burocracia amarilla y roja, ya que los ratones tienen dificultades para distinguir entre estos colores21.- Seleccione un pequeño espejo que se ajuste bien dentro de la caja de plástico transparente.
- Fije el espejo en su lugar en un ángulo de aproximadamente 45o con arcilla de modelado o cinta adhesiva para ver el comportamiento de los animales desde abajo.
- Coloque el conjunto de la caja y el espejo en un banco en una sala de pruebas de comportamiento dedicada silenciosa. Coloque el cilindro en la caja de plástico sobre el espejo.
- Organice el paño de manipulación, las pinzas y las tiras adhesivas en el banco junto a la caja de pruebas de comportamiento.
- Limpie la caja y el cilindro con 70% de etanol y toallas de papel. Deje que las superficies se sequen a fondo.
- Lleve a los ratones a la sala de pruebas de comportamiento. Permita que los ratones se aclimaten a la sala de pruebas durante al menos 30 minutos antes de las pruebas de comportamiento.
- Retire los suministros de agua de las jaulas para minimizar los eventos de micción durante las pruebas, lo que puede interferir con el rendimiento eficiente de la prueba.
- Seleccione un pequeño espejo que se ajuste bien dentro de la caja de plástico transparente.
- Realizar la prueba de eliminación de adhesivo
NOTA: Esta prueba de comportamiento se realiza mejor por dos o tres investigadores: uno para operar los cronómetros y uno o dos para manejar los ratones y observar el comportamiento.- Utilice cada pinza para pelar una tira adhesiva de cada color.
- Elija qué color de tira corresponde a qué pata delantera y permanecer consistente durante todo el ensayo.
- Utilice el paño de manipulación para sujetar un ratón por el cuello y la espalda de tal forma que el ratón mantenga las patas delanteras lejos de su cuerpo y cabeza.
- Utilice pinzas para colocar una tira adhesiva en la superficie plantar de cada pata delantera. Utilice una presión delicada y consistente de los dedos para fijar las tiras a las patas.
- Coloque rápidamente el ratón en el cilindro de plástico. Inicie los dos cronómetros cuando el ratón tenga las cuatro patas en la caja de plástico.
- Utilice los dos cronómetros para registrar las latencias para los siguientes cuatro eventos: aviso de pata izquierda, eliminación de la pata izquierda, aviso de pata derecha, eliminación de la pata derecha.
- Registre un evento de aviso cuando el animal haga un reconocimiento inequívoco de la tira adhesiva agitando o estremeciendo la pata o mordiendo la tira.
- Registre un evento de eliminación cuando el animal retire efectivamente la tira de la superficie plantar de la pata delantera.
NOTA: El evento de eliminación no se descalifica por la adherencia de la tira o si la tira se aferra a la superficie lateral de la pata delantera. - Detenga el temporizador a 120 s si no se ha quitado la tira correspondiente.
- Registre los tiempos transcurridos para los cuatro eventos de la hoja de datos.
- Realizar una segunda prueba en cada ratón
- Permita que transcurra un mínimo de 5 minutos entre los ensayos para que un ratón individual reduzca el estrés, lo que puede interferir con el rendimiento eficiente en la prueba.
- Limpie el aparato con toallas de papel entre ratones en pruebas para eliminar los residuos al probar varios ratones de una sola jaula.
- Limpie bien el aparato con 70% de etanol y toallas de papel cuando pruebe ratones de varias jaulas.
- Invierta el orden de colocación de la pata de color para la segunda prueba de la sesión para aleatorizar cualquier efecto de color.
- Calcule la latencia media de cada evento entre dos ensayos por sesión diaria para cada animal.
- Utilice cada pinza para pelar una tira adhesiva de cada color.
- Limpie el aparato y el paño de manipulación a fondo con agua, reemplace los suministros de agua de la jaula y devuelva los ratones a su instalación de retención.
- Repita los pasos 3.1-3.2 en los sucesivos puntos de tiempo experimentales para un diseño de prueba de medidas repetidas.
NOTA: Repita los pasos 3.2.1-3.2.5.3 diarios durante 5 días antes de cualquier recopilación de datos para aclimatar a los animales a la tarea. Se recomienda la adquisición de datos de línea de base antes de la cirugía.
4. Análisis inmunohistoquímico de diaminobenzidina (DAB) de la supervivencia del injerto y la patología de lesiones
- Eutanasia a los animales y realiza una perfusión transcardial.
- Preparar soluciones de 0,1 M de solución salina con fosfato (PBS) y 4% de paraformaldehida (PFA) en PBS. Equilibre el pH de ambas soluciones a 7.4.
- Coloque las dos soluciones sobre hielo en una campana de humos. Coloque una bomba peristáltica en la campana de humos y ejecute la bomba para llenar el tubo con PBS. Ajuste el caudal de la bomba a 7 ml/min. Conecte una aguja de 25 G al tubo de salida de la bomba.
- Coloque una bandeja de drenaje con un sustrato suave en la capucha. Levante un extremo de la bandeja en un ángulo ligero para que los fluidos de perfusión drenen hasta el extremo inferior.
- Coloque un ratón en una cámara de inducción de anestesia. Llene la cámara con un 4% de isoflurano utilizando gas comprimido 100% de vehículo de oxígeno.
- Mueva el ratón anestesiado de la cámara a un cono nasal de anestesia. Disminuya el isoflurano al 2%.
- Realice una toracotomía para exponer el corazón. Suspenda la anestesia, ya que la toracotomía causa eutanasia.
- Coloque cuidadosamente la aguja de salida de la bomba de perfusión en el ventrículo izquierdo a lo largo del eje largo del corazón. No perforar el tabique cardíaco, ya que esto causará una perfusión deficiente.
- Utilice tijeras pequeñas para cortar la aurícula derecha y, a continuación, encienda inmediatamente la bomba peristáltica.
- Continúe el flujo de PBS hasta que el líquido que sale de la aurícula derecha se quede libre de sangre.
- Apague la bomba. Mueva el tubo de admisión de la bomba al contenedor de PFA. Reinicie la bomba. Continúe perfundiendo PFA hasta que el animal esté lo suficientemente rígido o hasta que se haya bombeado un volumen de 20 ml.
- Apague la bomba. Retire la aguja de salida del corazón. Mueva el tubo de admisión del PFA al PBS y elimine completamente el PFA del tubo.
- Retire el cerebro del cráneo mediante una disección cuidadosa. Coloque el cerebro en un recipiente pequeño lleno de 4% de paraformaldehído, y permita que el cerebro se posa durante la noche a 4 oC.
- Al día siguiente de la post-fijación, reemplace la P con PBS y 0.1% azida sódica. Almacene los cerebros en esta solución hasta la preparación para la seccionamiento histológico.
- Recoger 40-50 m secciones de tejido cerebral fijado con formaldehida a través de un microtome de congelación o vibratomo de temperatura ambiente.
- Prerreto de tejidos en 0.3% peróxido de hidrógeno en agua para inactivar peroxidasas endógenas, que pueden producir tinción inespecífica.
- Realizar la recuperación de antígenos utilizando tampón de ácido cítrico (10 mM de citrato de sodio, 0,05% polisorbato-20, pH 6,0) a 60 oC durante 30 min.
- Realice el etiquetado de anticuerpos por métodos estándar. Consulte Lundell et al.' informe22 de este laboratorio para más detalles.
- Utilice un kit de neutralización de IgG de ratón (ver Tabla de materiales)para reducir la reactividad cruzada con anticuerpos endógenos. Incubar los tejidos en el tampón de neutralización de IgG durante al menos 1 h a temperatura ambiente (RT), siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Utilice un anticuerpo primario de antígeno nuclear antihumano de ratón (dilución hNA; 1:500) al trasplantar células derivadas de iPSC humanas para localizar las células trasplantadas. Incubar los tejidos con el anticuerpo primario a 4oC durante 48-72 h con agitación suave.
- Después de retirar la solución de anticuerpos primarios, incubar los tejidos con anticuerpos secundarios anti-ratón conjugados con HRP a 1:250 dilución durante 2 h en RT.
- Realizar la reacción del cromógeno DAB por métodos estándar para revelar el inmunoetiquetado. Permita que se desarrolle la reacción DAB durante 5 a 10 minutos en RT.
- Fije los tejidos manchados a las diapositivas y aplique los resbalones de la cubierta utilizando métodos estándar.
- Cuantifique el número de celdas etiquetadas utilizando una estereología imparcial como se describió anteriormente23,24. Realice el análisis utilizando secciones ópticas de 20 m y un intervalo de sección entre tres.
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Representative Results
La cirugía de craneectomía facilita la lesión cerebral experimental y el trasplante de células terapéuticas: el modelo de impacto cortical controlado de la lesión cerebral y la posterior terapia de trasplante celular requieren una extracción cuidadosa del cráneo que pasa. La craniectomía se puede realizar en cualquier superficie dorsal del cráneo para permitir manipulaciones en la región cerebral de interés. El diagrama de la Figura 1 muestra un esquema de craneectomía de 5 mm de diámetro para descubrir cortices primarios somatosensoriales y motores (Figura1A). A las 24 h después de la craneectomía, se realizó una segunda cirugía para inyectar la suspensión de células neuronales derivadas de iPSC humana en capas profundas de la corteza (Figura1B). Algunos edema cerebrales son normales el primer día después de la craneectomía, y particularmente después de la cIF. Sin embargo, la vasculatura cerebral ahorrando durante todas las fases de este procedimiento es crucial para la supervivencia de la corteza. La Figura 2 ilustra el procedimiento de trasplante celular en un ratón con una hernia cerebral mínima, sangrado mínimo y vascularización cortical extensa. Estas características son buenos indicadores de pronóstico de una cirugía exitosa.
Las pruebas de eliminación de cinta adhesiva revelan déficits sensorimotores después de una lesión cerebral unilateral: se predijo que los parámetros del modelo de lesión cerebral descrito anteriormente afectarían a la función sensorial y motora de las extremidades anteriores. La prueba de eliminación de cinta adhesiva fue elegida para evaluar la gravedad de los déficits funcionales de las extremidades anteriores y los beneficios terapéuticos potenciales del trasplante de células. Los ratones fueron entrenados en el procedimiento de prueba durante 5 días, luego se les permitió descansar durante dos días antes de las pruebas de comportamiento basales. Las cirugías se realizaron el día siguiente a las pruebas de referencia. Las pruebas de comportamiento en este estudio se realizaron los días postoperatorios 1, 3, 5, 7, 10, 14, 21, 28, 35 y 42. La Figura 3 muestra los resultados de un experimento piloto en el que la función de las extremidades anteriores en ratones con craneectomía sola (sham) y con lesión cci se comparó con la función de la extremidad delantera en ratones ingenuos (n 11 ingenuos, 12 sham, 11 CCI). Los ratones que se sometieron a cirugía mostraron aumento transitorio de las latencias para notar estímulos adhesivos durante 1-3 días inmediatamente después de la cirugía (Figura3A,B). Los ratones mostraron déficits postoperatorios transitorios en la eliminación de adhesivos de la pata delantera ipsilateral también (Figura3C). Sin embargo, los ratones que se sometieron a CCI presentaron déficits significativos en el rendimiento motor en la pata delantera contralateral a la lesión en comparación con los ratones ingenuos hasta el día 28 postoperatorio (Figura3D). Estos datos también describen la gravedad inesperada de la pérdida sensorimotor en ratones craneotomizados sin CCI, lo que indica que la craniectomía quirúrgica en esta área también induce déficits neurofuncionales relacionados con TBI.
Inmunodetección de injertos celulares derivados de células madre pluripotentes inducidas por el ser humano (iPSC) en secciones cerebrales de ratón: se realizaron experimentos para determinar si las células neuronales derivadas de iPSC humanas sobrevivirían al trasplante a largo plazo en el cerebro del ratón. Las células madre neuronales humanas (NSC) derivadas de los ISP se diferenciaron en neuronas inmaduras o astrocitos in vitro utilizando métodos establecidos17. Los trasplantes de cada uno de los tres fenotipos de células neurales se probaron en nuestro modelo CCI de lesión cerebral traumática utilizando el procedimiento descrito anteriormente y descrito en la Figura2. Los ratones fueron eutanasiados para análisis histológicos a los 7 días después del trasplante. Las secciones cerebrales del ratón fueron inmunomanchadas para el antígeno nuclear humano (hNA). Los injertos de células humanas podrían distinguirse claramente del tejido huésped en la cirugía falsa y los cerebros CCI (Figura4). Los injertos de astrocitos (n.o 3 falsos, 2 CCI) mostraron una mala supervivencia en comparación con los NSC (n.o 12 falsos, 15 CCI) y las neuronas (n.o 11 falsos, 10 CCI), y no fueron considerados para experimentos futuros.
Figura 1 : Coordinar los parámetros de las manipulaciones quirúrgicas. Representaciones de dibujos animados de regiones cerebrales de ratón de interés. Los círculos rojos indican una craniectomía de 5 mm de diámetro. Una cruz roja indica el punto central de la craneectomía 2 mm lateral a bregma. (A) La región sombreada de la corteza cerebral en el diagrama superior se ve afectada por un CCI leve cuando se realiza una craneectomía como se muestra en el diagrama inferior. (B) La flecha azul en el diagrama superior indica la ubicación aproximada de las inyecciones celulares a 1,4 mm de profundidad desde la superficie cortical. La cruz azul en el diagrama inferior indica la colocación de la inyección celular 2 mm lateral y 1 mm posterior a bregma. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Monitorización intraoperatoria de la inyección de suspensión celular. Fotografía tomada a través de un microscopio de larga distancia de trabajo durante la inyección de células intraparenquimales. Las características anatómicas se anotan para mayor claridad. El cuero cabelludo oscurece parcialmente el sitio de la cirugía para minimizar la deshidratación durante el procedimiento. Se puede producir un sangrado menor durante la penetración de la aguja, como se muestra, lo que no es motivo de preocupación si los vasos corticales grandes permanecen intactos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Evaluación conductual de la integración sensorimotor después de una lesión cerebral. Los ratones que se sometieron a craneectomía y CCI se compararon con controles ingenuos y con ratones que sólo se sometieron a una cirugía falsa (n 11 ingenuos, 12 farsantes, 11 CCI). Los datos se presentan como latencias medias del grupo, con barras de error que indican SEM. (A) Los ratones sometidos a CCI mostraron una mayor latencia para reconocer los estímulos adhesivos aplicados a la pata delantera ipsilateral en el primer día postoperatorio. (B) Los ratones sometidos a craneectomía o CCI mostraron una latencia sustancialmente mayor para notar estímulos adhesivos aplicados a la pata delantera contralateral en los días 1 y 3 postoperatorios. (C) Los ratones sometidos a craneectomía o CCI mostraron una latencia sustancialmente mayor para eliminar los estímulos adhesivos de la pata delantera ipsilateral en los días 1 y 3 postoperatorios. (D) Los ratones sometidos a craneectomía o CCI mostraron una latencia sustancialmente mayor para eliminar los estímulos adhesivos de la pata delantera contralateral en los días postoperatorios 1-5. Los déficits motores en ratones con CCI persistieron fuertemente durante 28 días después de una lesión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Inmunohistoquímica DAB para injertos de células humanas en cerebros de ratón. Los IPSC humanos se diferenciaron en células madre neuronales (NSC), neuronas o astrocitos in vitro. Los cultivos celulares se trasplantaron en cerebros de ratón con o sin CCI. Los ratones fueron eutanasiados para análisis histológicos siete días después del trasplante de células. Las micrografías representan resultados representativos de la tinción de antígenos nucleares humanos. Los conjuntos de inserción negros representan marcadores para la cuantificación estereológica de los números de celda (cian) y el volumen del injerto (rojo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Mild CCI como sistema modelo para probar la terapia regenerativa experimental
El modelo CCI es una herramienta valiosa para investigar los mecanismos de disfunción tisular después de una lesión mecánica en la corteza. La adenabilidad de los parámetros de lesión es una característica atractiva de este modelo. Alterar la profundidad Z del impacto, la velocidad o el tiempo de permanencia puede aumentar o disminuir la gravedad de la lesión según lo deseado por el investigador10,25. El modelo leve de CCI de lesión cerebral contusiva, cuando se realiza correctamente, debe causar muerte celular cortical modesta y cavitación mínima. La craneectomía y la extirpación del colgajo del cráneo deben realizarse con mucho cuidado. La fuerza descendente excesiva aplicada al taladrar la zanja de craneectomía puede causar lesiones corticales debido al calentamiento y la vibración. La interrupción mecánica de la dura mater durante la extracción de la solapa del cráneo predice casi uniformemente lesiones corticales graves. Es probable que la interrupción de los vasos sanguíneos corticales principales resulte en lesiones excesivas de la corteza y es motivo para excluir al animal del experimento. Desafortunadamente, los signos de una lesión exacerbada pueden ser sutiles el día después de la cirugía. Ni el edema ni la ruptura de vasos corticales pequeños son necesariamente indicadores negativos. Los hematomas y la coloración anormal debida a la isquemia son indicadores más claros de complicación quirúrgica. Documentar eventos intraoperatorios y correlacionar complicaciones con resultados histopatológicos son cruciales para perfeccionar una buena técnica de craneectomía.
Cabe señalar que el modelado mTBI en animales viene con ciertas advertencias. Hay numerosos modelos preclínicos de mTBI que no sean el modelo presentado aquí. TBI experimental puede ser inducido a través de fuerzas mecánicas, ondas explosivas a través del aire, o una combinación de estas fuerzas26,27,28. Las lesiones leves a graves se juzgan mediante una combinación de resultados histopatológicos y conductuales (revisados en Petraglia29 y Siebold30). Los déficits de comportamiento en roedores pueden resolverse en cuestión de días a semanas31, mientras que los déficits de los pacientes mTBI humanos pueden persistir durante meses en forma de síndrome post-conmocionivo32. Aunque ningún modelo es un modelo analógico completo para el mTBI clínico, las pruebas preclínicas revelan mecanismos fisiológicos que no se pueden evaluar en la condición humana.
Los pasos más importantes en el procedimiento de trasplante de células son la manipulación e inyección de la suspensión celular. El manejo brusco causa la lisis celular, lo que conduce a la liberación de ADN genómico pegajoso y la agregación de las células suspendidas supervivientes. El diámetro de la punta de la aguja debe ser lo suficientemente ancho como para permitir una salida suave de la suspensión; flujo restringido causa el suministro discontinuo como los sedimentos de suspensión dentro de la aguja. Al seguir este protocolo y evitar los escollos discutidos aquí, los injertos robustos eran visibles después de los tiempos de supervivencia de 7 días (Figura4). La supervivencia del injerto a largo plazo en un modelo preclínico es clave para determinar la eficacia terapéutica potencial de este enfoque.
Aplicación de la prueba de eliminación de cinta adhesiva al modelado de lesiones cerebrales contusivas
La prueba de eliminación de adhesivos revela déficits neurológicos positivos en términos de mayor latencia para eliminar los estímulos adhesivos. El principal inconveniente potencial de esta prueba es la probabilidad de un rendimiento inhibido debido a factores no relacionados con la lesión. Manejar el estrés puede reducir el comportamiento exploratorio del ratón33,por lo que es crucial que los animales se sometan a una amplia aclimatación de restricción antes de la recolección de datos de referencia. Es importante eliminar los suministros de agua al menos 30 minutos antes de la prueba con el fin de mitigar los eventos de congelación relacionados con la micción. Por último, el aparato de ensayo debe limpiarse con frecuencia, ya que los animales pueden distraerse en el olor de las señales de olor de animales desconocidos.
Los resultados presentados aquí muestran déficits motores de pata delantera significativa contralaterales a LEVE CCI hasta 28 días después de la lesión. Por el contrario, las pruebas simultáneas utilizando la prueba de cilindro34 y la aceleración de rotarod3 mostraron déficits funcionales inducidos por lesiones que se resolvieron en un plazo de 5-10 días (datos no mostrados). La eliminación de cinta adhesiva se ha utilizado en una variedad de experimentos que evalúan déficits unilaterales en el comportamiento integrador sensorimotor7,35. La prueba también se utilizó recientemente para evaluar la recuperación de la función motora tras la intervención regenerativa para la lesión de la médula espinal cervical36. El rango dinámico de rendimiento en esta prueba se puede ajustar para la latencia o la variación de las especies mediante la selección de adhesivos de diferente resistencia. Aquí, se sugiere que la cinta eléctrica 3M es un estímulo óptimo para los ratones basado en la disponibilidad, durabilidad y una latencia sustancialmente mayor para eliminar los estímulos después de un CCI suave. Aunque los experimentos preliminares que se muestran aquí no combinan el trasplante de células y las pruebas de comportamiento, los experimentos en curso en nuestro laboratorio evaluarán la supervivencia del trasplante y los efectos simultáneos en la recuperación del comportamiento sensorimotor de lesiones cerebrales a los 56 años días después del trasplante.
Refinamiento de la inmunodetección DAB de injertos de células humanas
La inmunohistoquímica DAB fue elegida con el fin de producir un etiquetado fuerte y persistente de células humanas en el tejido del ratón para la cuantificación estereológica posterior. El pretratamiento con peróxido de hidrógeno es crucial para reducir la tinción inespecífica en el tejido cerebral debido a peroxidasas endógenas en eritrocitos. La tinción inespecífica en estos experimentos se redujo aún más utilizando un kit de neutralización de IgG de ratón. Este kit utiliza productos químicos patentados para reducir la antigenicidad de los IgGs de ratón endógenos, que pueden extravasar en el tejido cerebral después de TBI37. Los primeros intentos emplearon una combinación de anticuerpos primarios anti-hNA de ratón, anticuerpos secundarios conjugados con biotina y etiquetado terciario conjugado de estreptavidina-HRP utilizando el kit ABC de Vector Laboratories. El conjugado ABC exhibió una extensa tinción DAB inespecífica en la corteza ipsilateral a la craneectomía (datos no mostrados). Los ensayos de tinción posteriores emplearon anticuerpos secundarios directamente conjugados con HRP. Este protocolo modificado produce tinción nuclear de alta resolución con antecedentes muy reducidos para todos los tipos de células derivadas de hiPS y condiciones de cirugía (Figura4). Los experimentos inéditos de este laboratorio utilizando esta técnica de tinción DAB modificada detectan células positivas de hNA en cerebros de ratón 56 días después de un CCI leve. En general, un procedimiento de etiquetado de anticuerpos binarios ahorró tiempo y produjo una inmunomancha más clara en comparación con el procedimiento tradicional del kit DE etiquetado terciario ABC. Este protocolo podría ser útil para otros estudios preclínicos de células humanas trasplantadas en el sistema nervioso central del ratón.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por una subvención del Centro de Neurociencia y Medicina Regenerativa (CNRM, número de subvención G170244014). Agradecemos la asistencia de Mahima Dewan y Clara Selbrede en estudios piloto de eliminación de adhesivos. Kryslaine Radomski realizó cirugías preliminares de lesión cerebral y trasplante de células. Amanda Fu y Laura Tucker del laboratorio central de USU CNRM Preclinical Studies proporcionaron valiosos consejos sobre cirugías de animales y pruebas de comportamiento, respectivamente.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringes | Becton Dickinson (BD) | 309659 | |
| 1.7 ml flip top test tubes | Denville | C2170 | |
| 10 microliter syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| 25G Precision Glide syringe needles | Becton Dickinson (BD) | 305122 | |
| 70% ethanol | Product of choice; varies by region | ||
| acetaminophen oral suspension | Tylenol (Children's) | Dilute to 1 mg/ml in water | |
| anesthetic vaporizer | Vetland | 521-11-22 | |
| animal handling cloth | Purchase from department store | ||
| Betadine | Purdue Products | NDC-67618-151-32 | |
| compressed oxygen | Product of choice; varies by region | ||
| cyclosporine A | Sigma-Aldrich | 30024-100mg | |
| DAB staining kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418-500ml | |
| DMEM | Invitrogen (ThermoFisher) | A14430-01 | |
| donkey anti-mouse IgG antibody, HRP conjugated | Jackson ImmunoResearch | 715-035-151 | |
| electrical tape | 3M Corporation | Purchase from department store | |
| fine tweezers | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| glass capillary pipettes, 1 mm OD, 0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100F-3 | |
| High Speed Rotary Micromotor Kit | Foredom Electric Co. | K.1070 - K.107018 | |
| Ideal Micro Drill Burr Set Of 5 | Cell Point Scientific | 60-1000 | |
| Impact One Stereotaxic Impactor for CCI | Leica Biosystems | 39463920 | |
| isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-60 | |
| lab bench timers | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Micropipette puller | MicroData Instruments, Inc. | PMP-102 | Any puller will suffice |
| Microscope cover slips | Fisherbrand | 12-545-E | |
| Microscope slide mounting medium | Product of choice | ||
| mirror | Purchase from department store | ||
| mouse anti-human nuclear antigen antibody | Millipore | MAB1281 | |
| Mouse on Mouse blocking kit | Vector Laboratories | BMK-2202 | |
| needle holder hemostat | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| ophthalmic ointment | Falcon Pharmaceuticals | NDC-61314-631-36 | |
| ophthalmic spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| plastic box | Purchase from department store | ||
| plastic cylinder | Purchase from department store | ||
| QSI motorized syringe pump | Stoelting | 53311 | |
| Removable needle compression fitting | Hamilton | 55750-01 | |
| small rodent stereotaxic frame | Stoelting | 51925 | |
| small scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| StemPro Accutase | Invitrogen (ThermoFisher) | A1110501 | |
| Sterile alcohol prep pads | Fisherbrand | 06-669-62 | |
| sterile cotton swabs/Kendall Q-tips | Tyco Healthcare | 540500 | |
| Sterile saline | Hospira | NDC-0409-1966-07 | |
| Stopwatches (2) | Fisher Scientific | 06-662-56 | |
| Superfrost Plus Gold microscope slides | Fisherbrand | 15-188-48 | |
| sutures - 5.0 silk with curved needle | Oasis | MV-682 |
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