Summary
SUMO är ett viktigt och starkt bevarade, små ubiquitinliknande modifierande protein. I detta protokoll beskriver vi användningen av ett stress-tolerant rekombinant SUMO-svällningsprotein (kmUTAG) för att visualisera infödda, otaggade SUMO-konjugat och deras lokalisering i en mängd olika cell typer.
Abstract
Här presenterar vi en ny metod för att studera sumoylering av proteiner och deras sub-cellulär lokalisering i däggdjurs celler och tallvedsnematoden oocyter. Denna metod använder en rekombinant modifierad SUMO-svällning protein fragment, kmUTAG, som härrör från Ulp1 SUMO proteas av stress-toleranta spirande jäst Kluyveromyces marxianus. Vi har anpassat Kmutags egenskaper i syfte att studera sumoylering i en mängd olika modell system utan användning av anti kroppar. För studien av SUMO har KmUTAG flera fördelar jämfört med antikroppsbaserade metoder. Detta stress-toleranta SUMO-svällningsreagens produceras rekombinantly, det erkänner infödda SUMO ISO former från många arter, och till skillnad från kommersiellt tillgängliga anti kroppar det visar minskad affinitet för fri, okonjugerad SUMO. Representativa resultat som visas här inkluderar lokaliseringen av SUMO-konjugat i däggdjurs vävnads odlings celler och nematodeoocyter.
Introduction
Syftet med denna metod är att under lätta studier och analys av SUMO-konjugerade proteiner med hjälp av rekombinant SUMO-svällning UTAG (Ulp Domain tag) protein. Som beskrivs nedan kan UTAG användas i stället för andra reagenser och metoder för att rena, upptäcka och visualisera SUMO-modifierade proteiner. Beroende på tillväxt förhållanden, celler kan innehålla hundratals eller tusentals proteiner som modifieras med SUMO eller SUMO kedjor (för granskning se Kerscher et al. 20061 och kerscher 20162). Detta utgör en avsevärd svårighet för funktionella analyser av specifika SUMO-modifierade proteiner, särskilt eftersom endast en bråkdel av en viss sumoylation mål faktiskt ändras3. Förutom deras roller i viktiga cellulära processer såsom transkriptionell reglering, protein homeostas, reaktionen på cellulär stress, och kromatin remodeling under Mitosen och meiosis; Det har nu blivit tillräckligt tydligt att Sumo, Sumo-modifierade proteiner och Sumo-utbildningsavsnitt också har potential som bio markörer för sjukdomar som cancer och neurodegenerativa sjukdomar4,5,6 ,7. Detta understryker behovet av robusta, pålitliga och lättillgängliga verktyg och innovativa metoder för detektion och funktionell analys av SUMO-modifierade proteiner i en mängd olika celler och prover.
I många system är sumospecifika anti kroppar de reagenser som är val för detektion, isolering och funktionella analyser av Sumo-modifierade proteiner8,9. Vissa kommersiellt tillgängliga SUMO-specifika anti kroppar är dock dyra, begränsade i kvantitet eller tillgänglighet, benägna att uppvisa vilt variabla affiniteter och kors reaktivitet, och i vissa fall saknar reproducerbarhet10. En alternativ metod är uttrycket av epitop-taggade Sumo i transformerade celler och organismer, men länka epitop Taggar till Sumo kan artificiellt sänka sin konjugering till protein mål11. Dessutom är epitoper inte användbart när otransformerade celler eller vävnader utvärderas.
Ulp1 är en conserveras SUMO proteashämmare från S. cerevisiae att både bearbetar Sumo föregångaren och desumoylates Sumo-konjugerade proteiner12. Vi utvecklade utag reagens baserat på den serendipitous observation att en mutation av den katalytiska Cystein (C580S) i Ulp1's Sumo bearbetning Ulp domänen (UD) inte bara förhindrar Sumo klyvning men också fällor Sumo-konjugerade proteiner med hög aviditet12. För enkelhetens skull hänvisade vi till denna carboxy-Terminal SUMO-svällning Ulp1 (C580S) fragment som UTAG (förkortning för UD TAG). UTAG är ett rekombinant Pan-SUMO-svällningsprotein som utgör ett användbart alternativ till anti-SUMO-antikroppar som används för isolering och detektion av SUMO-modifierade proteiner. Viktigt är att det specifikt erkänner Native-vikas, konjugerad Sumo och inte bara en eller flera epitoper på Sumo. För att förbättra både protein stabilitet och SUMO bindande styrka UTAG, genererade vi en variant av UTAG från stress-toleranta jäst Kluyveromyces marxianus (km). Kmutag binder tätt Sumo-konjugat med HDAC vid nanomolära affinitet13. KmUTAG är dessutom resistent mot förhöjda temperaturer (42 ° c), Reduktions medel (5 mM TCEP-tris (2-carboxyeyl) fosfinhydroklorid), denatureringsmedel (upp till 2 M urea), oxidations medel (0,6% väteperoxid) och icke-joniska rengörings medel. Denna stress tålighet är fördelaktig under hårda renings förhållanden och förlängda inkubations tider, vilket säkerställer dess stabilitet och SUMO-svällningsaktivitet. Det är dock inte överraskande att Kmutags SUMO-svällningsaktivitet är oförenlig med Cystein-modifierande reagenser, joniska rengörings medel och helt denaturerade protein extrakt. Kmutags anmärknings värda affinitet och egenskaper tyder på att denna reagens kan bli en del av standardrepertoaren för studiet av sumoylerade proteiner i flera arter.
Här erbjuder vi en enkel metod för att detektera SUMO-modifierade proteiner i däggdjurs celler och nematoder med hjälp av ett rekombinant fluorescerande mCherry-KmUTAG fusions protein (kmUTAG-fl).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. sumodetektion i fasta vävnads odlings celler med rekombinant KmUTAG-FL SUMO-svällningsprotein
- Odla vävnad kultur celler val på 22 mm runda täckglas i 6-well TC plattor tills 70%-80% konflytande. Utför steg 1.2 – 1.8 i 6-brunn plattan.
- Tvätta cellerna kort med 1 mL DPBS (Dulbecco ' s fosfatbuffrad saltlösning)
- För fixering, Bered en ny lösning av 4% paraformaldehyd (PFA) lösning (utspädd i DPBS). För att fixa celler, tillsätt 2 mL 4% PFA i DPBS till varje brunn. Inkubera cellerna i 20 minuter i rums temperatur. Obs: alla steg som använder PFA ska utföras i en laboratorie skydds huv och PFA måste kasseras på rätt sätt.
- Tvätta de fasta cellerna 3x i 1 mL DPBS medan du nuterar plattan, 5 min varje tvätt.
- För att permeabilisera celler, Inkubera i 15 min med 0,1% Triton X-100 i DPBS
- Tvätta cellerna 3x i 1 mL DPBS medan du nuterar plattan, 5 min varje tvätt
- Inkubera cellerna med 500 μL av 0,1 M glycin-HCL (pH 2,0) för 10 s, därefter neutraliserar pH omgående med 500 μL av 10x SUMO Proteasbuffert (SPB).
- Tvätta cellerna 3x i 1 mL DPBS medan nutating plattan, 5 min varje tvätt
- Ta bort täckglasen från brunnen och placera dem i en luft fuktighets kammare. Fortsätt sedan med inkubationer på täckglasen enligt följande:
- Endast för UTAG-fl-färgning: Blanda 1 μg UTAG-fl med 100 μL 1x SPB innehåll ande 5 mM TCEP i ett rör, Pipettera blandningen till cellerna på täckglasen och inkubera vid rums temperatur i 1 h i luft fuktighets kammaren.
- Alternativt, för UTAG-FL och anti SUMO1 anti kropp co-färgning, Fortsätt med följande:
- Blanda i ett rör 1 μg UTAG-FL och 0,5 μL SUMO2/3 8A2 (erhålls för utvecklings studier Hybridoma bank9) med 100 μl blockerande buffert, Pipettera blandningen på täckglasen och inkubera i rums temperatur i 1 h.
- Tvätta cellerna på täckglasen 3 gånger med 200 μL DPBS, 5 min varje tvätt.
- Blanda i ett rör 0,5 μL anti-mus Alexa fluor 488 konjugerad anti kropp med 100 μL blockeringsbuffert, Pipettera blandningen på täckglasen och inkubera i rums temperatur i 1 h.
- För att tvätta täckglasen, Pipettera 200 μL DPBS på varje täckglas och låt verka i 10 min. Upprepa tvätt 2 gånger.
- Ta bort täckglasen från den sista tvätten och vänd den till en förrengjord mikroskopi-bild med en droppe monterings medium (se material tabell).
- Förvaras över natten i en-20 ° c frys innan du tittar under Mikroskop. Visualisera med lämpliga filter uppsättningar för DAPI (DNA), Texas Red (kmUTAG-fl), och Alexa fluor 488 (om valfri SUMO2/3 co-färgning utförs).
2. SUMO detektion i fasta tallvedsnematoden gonader med hjälp av UTAG-fl
- Överföra vuxna hermafroditer till en 8 μl droppe av äggbuffert14 på en plus-laddad Slide som har belagts med Poly-L-Lysin. Släpp gonader från maskar med 27,5 G nålar. Fortsätt med antingen anti kropps märkning eller UTAG-fl-märkning.
- Gör så här för att märka prover på anti kroppar:
- Frys-spricka prover i flytande kväve och sedan fast över natten i-20 ° c metanol i en Coplin burk.
- Även i Coplin burkar, tvätta dia bilder för 3 gånger i 1x PBS, sedan blockera för 20 min i PBS innehåller 0,5% BSA och 0,1% Tween 20.
- Tillsätt 30 μL anti-SUMO 6F2-antikropp (1:10) till varje bild som täcker proverna. Inkubera över natten i en fuktighets kammare vid 4 ° c.
Anmärkning: SUMO 6F2 erhölls från utvecklings studier Hybridoma bank15. - I Coplin burkar, tvätta dia bilder för 2 min i 1x PBS, sedan täcka och inkubera prover med 30 μL DyLight 488 get-anti mus sekundär anti kropp (1:200) för 1,5 timmar i en luft fuktighet kammare vid rums temperatur.
- I Coplin burkar, tvätta dia bilder för 2 min i 1x PBS, utföra ett snabbt dopp i dH20, och sedan montera bilderna med monterings medium (se tabell över material).
- För KmUTAG-fl märkning, Fortsätt med följande:
- För att fixa celler, tillsätt 1 volym 8% PF till prover för en slutlig koncentration på 4% PF. fixera i 10 min i en luft fuktighets kammare och sedan släcka reaktionen genom att överföra dia bilder till en Coplin burk som innehåller 1x PBS med 0,1 M glycin i minst 5 min.
- I Coplin burkar, tvätta celler för 5 min i 1x PBS, sedan permeabilize proverna i 1x PBS innehåller 0,1% Triton-X för 10 min.
- Tvätta i en Coplin burk i minst 5 min i 1x PBS, tillsätt sedan 200 μL av 0,1 M glycin-HCl (pH = 2,0) till proverna på bilden i 10 sekunder. Tillsätt omedelbart 200 μL 10x SPB för att neutralisera pH-värdet.
- Tvätta bilden i 1x PBS i en Coplin-burk i 5 min.
- Ta bort glaset från tvätt och Pipettera 100 μL 1x SPB + 5mM TCEP innehåll ande 2 μg UTAG-fl till nematoderna på glasen och inkubera i luft fuktighets kammaren i 1 h utan att gunga.
- Lämna tillbaka bilden till Coplin burken och tvätta i 15 min i 1x PBS
- Ta bort bilden från tvätten, Använd en laboratorie tork för att torka runt provet och montera sedan glasen med 5 μL monterings medium (se material tabell). Förvara glasen vid 4 ° c. Visualisera med hjälp av lämpliga filter uppsättningar för DAPI (DNA), Texas Red (kmUTAG-fl), och DyLight 488 (SUMO2/3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
KmUTAG-fl är ett rekombinant, mCherry-märkt SUMO-svällningsprotein. För att producera kmUTAG-fl, klonade vi en Codon-optimerad mCherry-kmUTAG i pSPOT1 bakteriell överuttryck Plasmid (figur 1). Efter induktion renades kmUTAG-fl-proteinet på spot-TRAP, elueras och frystes fram till vidare användning. För att säkerställa SUMO-svällningsaktiviteten hos KmUTAG-fl bekräftade vi bindningen till SUMO1-konjugerade pärlor och utfällning av ett SUMO-CAT fusions protein (data visas inte, men se tidigare arbete13).
KmUTAG-fl inkuberas med fasta PNT2 celler visade en distinkt nukleär färgning när observeras med hjälp av lämpliga filter set (Chroma) och en 100x oljeimmersion mål på en Epilys Zeiss Axioplan Mikroskop (figur 2-övre högra panelen). Både diffus nukleär färgning och distinkt nukleär Foci syntes. Nukleär lokalisering bekräftades med hjälp av co-färgning med DAPI (figur 2-övre vänstra panelen). I överensstämmelse med SUMO-svällningsaktiviteten i kmUTAG-fl påminde kärn lokaliserings mönstret om SUMO2/3-färgning. Co-färgning med anti SUMO2/3 8A2 anti kropp (figur 2 -nedre vänstra panelen) bekräftade co-lokalisering av kmUTAG-fl med SUMO2/3-signalen (figur 2-Merge, nere till höger). Detta validerar effekten av KmUTAG-fl för att detektera SUMO2/3 i däggdjurs celler.
Eftersom kmUTAG-fl uppvisar Pan-SUMO specificitet, testade vi också det på C. elegans nematoder att avgöra om lokaliserings mönstret för kmutag-fl skulle motsvara de tidigare rapporterade mönstren av anti-Sumo anti kroppar och mcherry:: Sumo fusions proteiner 8,15. Isolerade gonader från oocytproducerande vuxna hermafroditer behandlades för märkning med antingen anti-SUMO anti kropp eller kmUTAG-fl. i enlighet med tidigare rapporter 8, anti-Sumo anti kropp initialt lokaliserad till nukleoplasm av sena meiotiska profas oocyter (figur 3a, C). Den omfördelas sedan till den centrala ringen komplex (RC) av Parade homologer (bivalents) som kärn kraft kuvertet bröt ner och kromosomer kongressen mot metafasplattan (figur 3b, D). Komponenter i ringen komplexa, som ligger mellan DAPI-färgade homologs, inkluderar både GEI-17 (a E3 SUMO Ligase) och SUMO-konjugerad kromfarmakokinetisk sin 8. I parallella preparat, gonader märkt med KmUTAG-fl avslöjade liknande mönster (figur 3e, F). Kmutag-fl skiftade från märkning av nukleoplasmen att koncentrera sig på ringen komplexa, som oocyter började (-1 äggcell i figur 3e) och avslutade (-1 äggcell i figur 3F) processen för kärn ämnes uppdelning. Dessa resultat validerar kmutag-fl som ett användbart verktyg för analys av meios och Sumo-relaterade processer i C. elegans och möjligen andra nematoder.
I figur 1. Schematisk representation av fusions proteinet kmUTAG-fl SUMO-svällning som används i denna metod. Den Spot-tag vektor pSPOT1 används för uttrycket av KmUTAG-fl. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. kmUTAG-fl colocalization med SUMO2/3 i däggdjurs celler. PNT2 celler odlades på täckglas, fast, och färgas med både KmUTAG-fl och anti-SUMO2 8A2 anti kropp, innan du ansöker monterings material som innehåller DAPI. Bilder visualiserades med hjälp av ett konfokal Mikroskop och lämpliga filter för DAPI (DNA), mCherry (kmUTAG-fl), och GFP (anti SUMO2/3). kmUTAG-fl colokaliserad med SUMO2/3 i PNT2-celler. Scale bar = 20 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
I figur 3. Jämförelse av Sumo märkning av anti-Sumo anti kroppar och kmutag-fl under C. elegans äggcell mognad. (A) Schematisk av den proximala C. elegans gonaden. Utveckla oocyter in i nektar (sprmth) en efter en där de befruktas innan de kommer in i livmodern. Oocyter i läge-1, omedelbart intill nektar genomgå nukleär kuvertet uppdelning före befruktning. Efter befruktning, spermie kromatin förblir i ett kondenserat tillstånd tills äggcell kromosomer slutföra sina meiotiska divisioner. (B) Schematisk som visar strukturen hos ett kromosomalt bivalent som bildas efter homologa kromosomer har rekombinerat, demonteras deras synaptomenala komplex, och har kondenserats i förberedelse för metafas. En central ring Complex (RC) mellan homologer är berikad inte bara i Aurora Kinas och Checkpoint protein bub-1 utan även E3 Sumo Ligase GEI-17 och kromfarmakokinetiska synden. (C-D) En rad av att utveckla oocyter inom utväxande (C) och en nyligen befruktade äggcell i metafor av meios i (D) märkt med anti-Sumo anti kropp. (C-D) Full stora bilder till höger visar den sammanslagna (m) och enkanals DAPI (D) och anti-SUMO anti kropp (S AB) bilder av-2 och-1 kärnor och metafor I spindel regionen. o = metafas I-kromosomer av oocyte, s = spermie kromatin massa. (E-F) Utveckling av oocyter inom utväxande märkt med kmutag-fl. koncentrationen av kmutag-fl vid ring komplexet börjar strax före nedbrytning av kärn ämne (-1 oocyt i E) och blir till stor del begränsad till ring komplexet efter nukleära kuvert nedbrytning (-1 äggcell i F). Blå = DAPI. Skalbar = 5 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här introducerar vi användningen av kmUTAG-fl, ett rekombinant protein, för funktionella studier av SUMO i fasta däggdjurs celler och dissekerade tallvedsnematoden gonader. KmUTAG-fl är en stress-tolerant Pan-SUMO specifik reagens som känner igen och fällor infödda SUMO-konjugerade proteiner och SUMO kedjor. Eftersom SUMO ' s tertiär struktur är mycket bevarade är det mycket troligt att SUMO varianter från ytterligare modell och icke-modellsystem kan analyseras med kmUTAG-fl reagens. KmUTAG-fl kan utgöra en användbar alternativ-eller sekundär reagens för traditionella anti kropps infärgnings protokoll.
Det finns gott om prejudikat för användning av icke-antikroppsalternativ, inklusive lektiner för kolhydrat detektion samt Aptamer nukleotider och affimer peptider för in vivo märkning av proteiner 16,17,18 ,19. Dessutom, affimers och monobodies har genererats som binder Sumo och förhindra interaktion med Sumo-samverkande motiv (Sims) på andra protein18,20,21. Men såvitt vi vet är KmUTAG-fl det första rekombinant fluorescerande Pan-SUMO-svällningsproteinet för direkt visualisering av SUMO-konjugat i fasta celler. KmUTAG-fl härstammar från Ulp1 av en stress-tolerant jäst, K. marxianus, och detta kan förklara sin anmärknings värda stabilitet 13. Till skillnad från de flesta anti kroppar kräver KmUTAG inte en sekundär anti kropp för visualisering, och färgade celler syns lätt under fluorescensmikroskopet. Både våra analyser av SUMO-konjugaten i däggdjurs celler och tallvedsnematoden-gonader tyder på att KmUTAG-baserad avbildning positivt jämförs med SUMO-antikroppfärgning och visar lite brus (t. ex. jämföra figur 3a, B kontra figur 3D , E).
Kritiska steg i protokollet inkluderar användning av färsk paraformaldehyd och en kort fixeringstid för att hålla SUMO inbyggt-vikt så att den kan kännas igen av kmUTAG. Också, den korta behandlingen av fasta celler med den låga pH glycin lösning ökar dess känslighet för SUMO. Dock kan inte alla prover lämpar sig för analys med KmUTAG-fl. Som med antikroppsbaserade protokoll, när man försöker lokalisera SUMO i nya cell typer eller vävnader, kan rengörings medels val och tvättmedels koncentrationer vara viktiga variabler. I ändan planerar vi att generera ytterligare KmUTAG-fl varianter inklusive ett cell-penetrerande kmUTAG protein som kan användas för att upptäcka SUMO dynamik i levande celler, organoider, och vävnads biopsier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Rekombinant kmUTAG reagens tillhandahålls till forsknings samfundet via Kerafast.com.
Acknowledgments
Vi vill tacka alla medlemmar i Kerscher labbet för deras stöd, Nathalie Nguyen för kritisk läsning av manuskriptet, och Lidia EPP för sekvensering. Detta arbete har fått stöd av Samväldets forsknings kommersialiserings fond MF16-034-LS till OK. Forsknings stöd för W & M studenter tillhandahölls av Bailey-Huston Research Fund, och Charles Center Honors Fellowships till RY och CH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 30525-89-4 | |
| 6-Well Cell Culture Plates | Genesee Scientific/Olympus Plastics | 25-105 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-545-003 | Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | Gibco 14190144 | |
| Dylight 488 conjugated AffiniPure Goat Anti-Moue IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-485-146 | Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody |
| Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses | Fisherbrand | 12545101 | |
| FLUORO-GEL II with DAPI | Electron Microscopy Sciences | 50-246-93) | Mounting media in step 1.11 |
| FLUORO-GEL with DABCO | Electron Microscopy Sciences | 17985-02 | With DAPI added to 1 µg/mL; mounting media in step 2.2.5 |
| Glycine-HCl | Fisher BioReagents | BP3815 | |
| Glycine-HCl | ACROS Organics | 6000-43-7 | |
| KmUTAG-fl | Kerafast | KmUTAG reagents are available on Kerafast.com | |
| Oneblock Western-CL blocking buffer | Prometheus | 20-313 | |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Solution | Fisher BioReagents | BP3994 | |
| PNT2 cell line | Sigma-Aldrich | 95012613 | Normal prostate epithelium immortalized with SV40. |
| pSPOT1 | (ChromoTek GmbH) | ev-1 | https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf |
| SUMO 6F2 | DSHB | SUMO 6F2 | SUMO 6F2 was deposited to the DSHB by Pelisch, F. / Hay, R.T. (DSHB Hybridoma Product SUMO 6F2) |
| SUMO protease buffer [10x] | 500 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2% NP-40, 1.5 M NaCl | ||
| SUMO-2 Antibody 8A2 | DSHB | SUMO-2 8A2 | SUMO-2 8A2 was deposited to the DSHB by Matunis, M. (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2) |
| TCEP-HCL | GoldBio | 51805-45-9 | Used as a reducing agent at a concentration of 5mM |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | 9002-93-1 | Used for permeablization at 0.1% in DPBS/PBS(for worms) |
References
- Kerscher, O., Felberbaum, R., Hochstrasser, M. Modification of proteins by ubiquitin and ubiquitin-like proteins. Cell and Developmental Biology. 22, 159-180 (2006).
- Kerscher, O. SUMOylation. , John Wiley & Sons, Ltd. Chichester. 1-11 (2016).
- Hay, R. T.
- Fu, J., et al. Disruption of SUMO-specific protease 2 induces mitochondria mediated neurodegeneration. PLoS Genetics. 10 (10), e1004579-e1004579 (2014).
- Zhang, H., Kuai, X., Ji, Z., Li, Z., Shi, R. Over-expression of small ubiquitin-related modifier-1 and sumoylated p53 in colon cancer. Cell biochemistry and biophysics. 67 (3), 1081-1087 (2013).
- Wang, Q., et al. SUMO-specific protease 1 promotes prostate cancer progression and metastasis. Oncogene. 32 (19), 2493-2498 (2013).
- Karami, S., et al. Novel SUMO-Protease SENP7S Regulates β-catenin Signaling and Mammary Epithelial Cell Transformation. Scientific Reports. 7 (1), 46477 (2017).
- Pelisch, F., et al. A SUMO-Dependent Protein Network Regulates Chromosome Congression during Oocyte Meiosis. Molecular Cell. 65 (1), 66-77 (2017).
- Zhang, X. D., et al. SUMO-2/3 modification and binding regulate the association of CENP-E with kinetochores and progression through mitosis. Molecular Cell. 29 (6), 729-741 (2008).
- Baker, M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature News. 521 (7552), 274-276 (2015).
- Wang, Z., Prelich, G. Quality control of a transcriptional regulator by SUMO-targeted degradation. Molecular and Cellular Biology. 29 (7), 1694-1706 (2009).
- Li, S. J., Hochstrasser, M. A new protease required for cell-cycle progression in yeast. Nature. 398 (6724), 246-251 (1999).
- Peek, J., et al. SUMO targeting of a stress-tolerant Ulp1 SUMO protease. PLoS ONE. 13 (1), e0191391 (2018).
- Edgar, L. G. Chapter 13 Blastomere Culture and Analysis. Methods in Cell Biology. 48, 303-321 (1995).
- Pelisch, F., et al. Dynamic SUMO modification regulates mitotic chromosome assembly and cell cycle progression in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 5 (1), 769 (2014).
- Dillingham, M. S., et al. Fluorescent single-stranded DNA binding protein as a probe for sensitive, real-time assays of helicase activity. Biophysical Journal. 95 (7), 3330-3339 (2008).
- Ruckman, J., et al. 2'-Fluoropyrimidine RNA-based aptamers to the 165-amino acid form of vascular endothelial growth factor (VEGF165). Inhibition of receptor binding and VEGF-induced vascular permeability through interactions requiring the exon 7-encoded domain. The Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20556-20567 (1998).
- Hughes, D. J., et al. Generation of specific inhibitors of SUMO-1- and SUMO-2/3-mediated protein-protein interactions using Affimer (Adhiron) technology. Science Signaling. 10 (505), eaaj2005 (2017).
- Lopata, A., et al. Affimer proteins for F-actin: novel affinity reagents that label F-actin in live and fixed cells. Scientific Reports. 8 (1), 6572 (2018).
- Gilbreth, R. N., et al. Isoform-specific monobody inhibitors of small ubiquitin-related modifiers engineered using structure-guided library design. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7751-7756 (2011).
- Berndt, A., Wilkinson, K. A., Heimann, M. J., Bishop, P., Henley, J. M. In vivo characterization of the properties of SUMO1-specific monobodies. Biochemical Journal. 456 (3), 385-395 (2013).
