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Biology

Fabrication de microbilles d'amyloïde-Sécrétion d'alginate pour l'utilisation dans la modélisation de la maladie d'Alzheimer

Published: July 6, 2019 doi: 10.3791/59597
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Division of Pharmacy and Optometry, School of Health Studies, Faculty of Biology, Medicine and Health, University of Manchester, 2Division of Neuroscience and Experimental Psychology, School of Biological Sciences, Faculty of Biology, Medicine and Health, University of Manchester

Summary

Ce protocole illustre une méthode d'encapsulation cellulaire par la gélation physique rapide de l'alginate pour immobiliser des cellules. Les microbilles obtenues permettent une sécrétion contrôlée et soutenue de l'amyloïde au fil du temps et peuvent être utilisées pour étudier les effets de l'amyloïde sécrété dans les modèles in vitro et in vivo.

Abstract

Selon l'hypothèse de la cascade amyloïde, le premier déclencheur dans le développement de la maladie d'Alzheimer (MA) est l'accumulation de fragments toxiques d'amyloïde,mD(A), conduisant éventuellement aux caractéristiques classiques de la maladie : plaques amyloïdes, neurofibrillaires et perte synaptique et neuronale. L'absence de modèles précliniques non transgéniques pertinents reflétant la progression de la maladie est l'un des principaux facteurs qui entravent la découverte de traitements médicamenteux efficaces. À cette fin, nous avons développé un protocole pour la fabrication de microbilles d'alginate contenant des cellules sécrétrices d'amyloïdes utiles pour l'étude des effets de la production chronique de l'A.

Des cellules d'ovaire de hamster chinois précédemment transfectées avec un gène humain d'APP, sécrétant des cellules de 7PA2 de A(c.-à-d.), ont été employées dans cette étude. Un modèle in vitro tridimensionnel (3D) pour la libération soutenue de A a été fabriqué par encapsulation des cellules 7PA2 dans l'alginate. Le processus a été optimisé pour cibler un diamètre de perle de 500-600 m pour d'autres études in vivo. L'optimisation de l'encapsulation de cellules 7PA2 dans l'alginate a été exécutée altérant des paramètres de fabrication, par exemple, concentration d'alginate, taux de flux de gel, potentiel électrostatique, fréquence de vibration de tête, solution de gélification. Les niveaux de Sécrétés A ont été analysés au fil du temps et comparés entre les perles d'alginate et les méthodes standard de culture cellulaire (jusqu'à 96 h).

Une concentration de 1,5 x 106 cellules 7PA2/mL et une concentration d'alginate de 2% (w/v) tamponnées avec HEPES et la gélification subséquente dans le chlorure de calcium de 0,5 M pendant 5 min se sont avérées pour fabriquer les microbilles les plus stables. Les microbilles fabriquées étaient 1) de taille uniforme, 2) avec un diamètre moyen de 550 m, 3) contenant environ 100-150 cellules par microbille et 4) capables de sécrétiser A.

En conclusion, notre méthode optimisée pour la production de microbilles d'alginate stables contenant des cellules 7PA2 amyloïdes pourrait permettre la modélisation d'aspects importants de la MA in vitro et in vivo.

Introduction

La modélisation des maladies neurodégénératives est difficile en raison de la nature complexe et complexe du cerveau. Dans la maladie d'Alzheimer (MA), la perte progressive de la fonction synaptique et la mort des neurones est considéré comme un effet en aval de la surproduction soutenue et l'accumulation de bêta-amyloïde (A) peptides suite à un traitement anormal du précurseur amyloïde protéine (APP) selon l'hypothèse de cascade amyloïde1.

Afin de comprendre les mécanismes de cette pathologie induite par l'amyloïde et d'aider à l'identification de nouvelles cibles de traitement, les scientifiques ont développé divers modèles précliniques in vivo. Une catégorie de modèles utilise une injection de bolus d'un peptide synthétique de L'A dans le cerveau du rat2,3,4. La principale limitation de ces modèles est qu'ils s'appuient sur un seul point ou des traitements répétés avec des peptides A en concentrations élevées déposées en une seule fois. Cela est incompatible avec la nature chronique et soutenue de la libération de a dans la maladie5. Une autre catégorie de modèles in vivo est des modèles animaux transgéniques exprimant une ou plusieurs mutations génétiques liées aux variations familiales de la maladie6,7,8,9, 10. Cependant, puisque la MA familiale ne représente que moins de 5 % de tous les cas d'Alzheimer11, la pertinence de ces modèles dans la traduction de la MA sporadique chez l'homme est discutable12. Un autre inconvénient de l'approche transgénique est la formation accélérée de A dès la naissance, qui se traduit par des déficits dans la fonction cognitive et des changements pathologiques trop rapidement et agressivement pour ressembler à la progression de la maladie dans la MA sporadique chez les patients12 . Par exemple, le modèle 5x FAD produit des plaques en aussi peu que 1,5 mois13.

Fait intéressant, ces deux catégories se traduisent par des changements dans la fonction cognitive de pertinence à la recherche AD2,3,4,5,6, et parfois ils sont accompagnés par le l'apparition des caractéristiques pathologiques de la maladie telles que les plaques amyloïdes6,8, phosphorylation tau6,7 et/ou perte synaptique et neuronale7,9, 14. Mais si ces types de modèles peuvent nous donner un aperçu des effets des niveaux élevés d'amyloïde dans le cerveau, qui sont souvent associés à des stades ultérieurs de la MA, ils ne reflètent pas les changements antérieurs exposés en réponse à l'exposition chronique et soutenue à l'A peptide12, comme l'expression altérée des marqueurs synaptiques15 et des composants de la matrice extracellulaire16. Par conséquent, il reste encore un besoin pour créer un modèle chronique qui illustre plus précisément les effets de la sécrétion soutenue de A sur la cognition in vivo et illustre des changements dans la pathologie.

À cette fin, nous avons développé un système qui permet la sécrétion constante et soutenue de aded d'une manière contrôlée en immobilisant les cellules amyloïdes-sécrétrices dans les microbilles d'hydrogel, qui peuvent être ensuite implantées dans le cerveau adulte de rat pour modéliser des aspects sporadiques.

L'alginate était le biomatériau sélectionné car il est biocompatible et n'induit aucune réponse défavorable lorsqu'il est implanté in vivo17. L'encapsulation cellulaire dans les hydrogels d'alginate a été bien établie au cours des quatre dernières décennies. Le premier exemple de sa traduction à la clinique a été rapporté pour le traitement du diabète de type 1 mellitus17. Le premier rapport de l'encapsulation réussie des îlots de Langerhans remonte à 1980. La transplantation de microbilles contenant des cellules sécrétrices d'insuline a révolutionné les options de traitement pour les patients diabétiques car elle a restauré la fonction pancréatique, éliminant le besoin de thérapie par injection d'insuline18. Ces travaux rendent compte de la façon dont l'encapsulation cellulaire peut les protéger contre les contraintes externes, qu'elles soient mécaniques ou chimiques. En fait, les perles d'alginate agissent comme une barrière et isolent les cellules de l'environnement environnant préservant leur phénotype, tout en permettant un accès suffisant aux médias environnants pour les nutriments et le dégagement des sous-produits cellulaires19. En outre, l'utilisation de l'alginate permet l'appariement des propriétés mécaniques des tissus mous20. Les hydrogels d'alginate peuvent être accordés pour avoir une rigidité de 1-30 kPa, en variant simplement la concentration d'alginate et la densité de liaison croisée20,21. Il s'agit d'un aspect essentiel, non seulement pour maintenir l'expression phénotypique des cellules encapsulées in vitro, mais aussi pour éviter tout effet inflammatoire après l'engraftment in vivo22.

Dans ce protocole, des cellules 7PA2 - une lignée de cellules d'ovaire de hamster chinois qui est transfectée de façon stable avec un gène muté APP V717F humain23 - sont utilisées. Ces cellules produisent continuellement des produits catalytiques de l'APP, y compris A1-4224,25, et ont été utilisés pour générer a comme une alternative à la production synthétique dans les études précliniques, aigus in vivo26. Nous décrivons une méthode de fabrication pour immobiliser les cellules 7PA2 dans les microbilles d'alginate « molles », conçues pour permettre la sécrétion soutenue de biomolécules. Comme preuve de concept, nous rendons compte de la libération du peptideA-1-42 au fil du temps. L'alginate qui est utilisé est un alginate à faible viscosité avec un poids moléculaire de 120 000 à 190 000 g/mol et un rapport mannuronique à guluronique de 1,56 (M/G).

Dans d'autres études, ces microbilles peuvent être transplantées en toute sécurité dans les régions du cerveau de rat d'intérêt pour la MA (par exemple, l'hippocampe) pour étudier les effets de la sécrétion chronique de l'A sur le comportement in vivo et la pathologie exvivo. En outre, ce système peut être utilisé pour étudier les effets de la libération chronique de la maladie de La DmD dans les applications in vitro et ex vivo. Par exemple, les microbilles d'alginate contenant 7PA2 peuvent être co-cultivées in vitro avec des cultures neuronales ou astrocytiques afin d'évaluer les effets de l'exposition chronique à l'A sur les mécanismes cellulaires associés à la MA. En outre, cette méthode peut être utilisée pour examiner la relation entre la production chronique de a et la potentialisation à long terme dans l'électrophysiologie ex vivo.

Le point culminant de ce protocole est la modularité et la flexibilité de la méthode de fabrication, qui permet la fabrication de perles d'alginate avec une dimension cible par des paramètres de fabrication de réglage fin. Selon l'application, le protocole peut être ajusté pour obtenir des cibles sur mesure en ce qui concerne la taille des microbilles, la densité des cellules encapsulées et la rigidité des microbilles. Ce protocole peut être utilisé pour l'encapsulation d'une variété de types de cellules, en développant des modèles in vitro tridimensionnels (3D) plus pertinents pour étudier différentes pathologies. Nous avons récemment rapporté sur la façon dont les cellules encapsulées d'alginate peuvent être employées pour modéliser les premiers stades de la progression de cancer20.

Le concept du processus d'encapsulation est basé sur l'extrusion d'un jet laminaire de cellules suspendues dans une solution d'alginate par une buse. Une tête vibrante perturbe le jet avec une fréquence contrôlée résultant en gouttelettes à base d'alginate de taille égale. Un champ électrique externe permet la séparation des gouttelettes formées à base d'alginate, qui, au contact d'une solution enrichie en ions divalents, tels que les ions de calcium, peuvent rapidement se croiser, préservant leur forme sphérique. L'incubation dans la solution de gélation permet la formation de microbilles sphériques contenant des cellules dans un hydrogel physique homogène27. La taille cible des microbilles et des hydrogels d'alginate permet l'échange d'éléments nutritifs et d'oxygène avec les supports de culture cellulaire pendant de longues périodes (semaines). Figure 1 Un spectacle une représentation schématique de l'appareil d'encapsulation utilisé (Figure 1B).

Figure 1
Figure 1 : Le système d'encapsulation. (A) Représentation schématique du système d'encapsulation. Une suspension à cellules d'alginate est chargée dans une seringue (2) et alimentée à travers un réservoir à une vitesse d'extrusion fixée à la pompe à seringue (1). Dans le réservoir, un chapeau de vibration (3) vibre à une fréquence fixée par un générateur de forme d'onde (4) pour perturber le flux à intervalles égaux, formant des gouttelettes de taille égale. Lorsque la solution est alimentée par une buse (5) et que des gouttelettes sont formées, un potentiel électrostatique est appliqué sur une électrode (7) fixée par un générateur de tension (6), qui charge légèrement la surface des gouttelettes, ce qui permet au flux de se propager à la suite de la répulsion forces électrostatiques. Pendant que les gouttelettes s'engagent avec le bain de gel (8), Ca2-conduit le croisement de l'alginate entraîne la formation de microbilles sphériques. (B) Photographie de l'encapsulateur avant la fabrication de microbilles d'alginate. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

La taille des microbilles peut être modifiée en fonction de l'utilisation prévue. Afin de contrôler la taille de la microbille, les différents paramètres décrits à la figure 1A et dans le protocole sont ajustés en conséquence. Le diamètre interne de la buse utilisée a un impact substantiel sur la taille des gouttelettes; l'ajustement des paramètres d'encapsulation, à savoir la vitesse d'extrusion, la fréquence des vibrations et la tension, est essentiel pour parvenir à une distribution de taille cohérente. Tableau 1 décrit comment les différents paramètres peuvent modifier la taille des microbilles obtenues avec ce système.

paramètre Taille de la buse Fréquence des vibrations Débit Tension d'électrode
Image 1 Image 1 Image 1 Image 1
Taille de perle Image 1Image 1 Image 2 Image 1 –

Tableau 1 : Paramètres de fabrication et leur influence sur la taille des microbilles. Le tableau illustre comment chaque paramètre peut influencer la taille résultante des microbilles fabriquées, indépendamment de la buse et de la viscosité de la solution utilisée.

Protocol

1. Préparations

  1. Préparer 100 ml de 4 % (w/v) solution de stock d'alginate.
    1. Peser 4,4 g de sel de sodium alginate et ajouter la poudre sèche à 100 ml de saline tamponnée HEPES (HBS, 20 mM HEPES (0,477 g) avec 150 mM NaCl (0,877 g) dans de l'eau désionisée permettant l'hydratation.
    2. Utilisez un agitateur magnétique à 500 tours par minute (rpm) et chauffez jusqu'à 50 oC pour permettre une hydratation complète de l'alginate.
      REMARQUE : L'alginate peut avoir besoin d'une ou deux heures pour être complètement hydraté. Pour économiser à temps, la solution alginate peut être constituée un jour à l'avance du protocole d'encapsulation et stockée à 4 oC jusqu'au lendemain. Lorsque l'alginate a été réfrigéré, chauffer doucement jusqu'à 37 oC à l'aide d'un bain d'eau ou d'une plaque chaude et agiter avec un agitateur magnétique immédiatement avant l'utilisation.
    3. Filtre stérile de la solution alginate à l'aide d'un filtre en polyéthersulfone (PES) de 0,22 m avant utilisation. Le filtrage est recommandé à 37 oC pour faciliter l'écoulement de l'alginate. La viscosité augmentera si la température est autorisée à baisser.
  2. Préparer 1000 ml de 0,5 M CaCl2.
    1. Peser 55,49 g d'anhydre CaCl2 et dissoudre en 1 000 ml de HBS (20 mM HEPES et 150 mM NaCl dans 1 000 ml d'eau déionisée).
    2. Filtre stérile à l'aide d'un filtre PES de 0,22 m pore.
  3. Préparer 100 ml de mélange de dissolution.
    1. Préparer une solution HEPES de 100 mM (23,83 g) et 500 mM de dihydrate de citrate trisodique (147,05 g) en saline tamponnée de phosphate.
    2. Ajuster au pH 7.4 en utilisant NaOH ou HCl.

2. Mise en place du système d'encapsulation

  1. Nettoyer le capot à débit laminaire.
    1. Stériliser le capot à débit laminaire contenant l'encapsulateur à l'aide d'une exposition aux UV suivie d'une pulvérisation avec une solution d'éthanol v/v à 7%.
    2. Rincer le système d'encapsulator avec 10 ml de solution d'éthanol v/v de 70 % suivie de 10 ml d'eau déionisée stérile.
    3. Fixez la buse de 300 m et répétez l'étape 2.1.2.
    4. Vaporisez la bouteille contenant la solution d'alginate filtrée, la bouteille contenant la solution filtrée de chlorure de calcium et tous les outils, équipements et plaques de culture vides qui seront utilisés avec la solution d'éthanol v/v de 70 % et les placeront dans le capot d'écoulement laminaire. Avant d'utiliser, allumez à nouveau une lumière UV pendant 30 minutes pour bien stériliser.
    5. Préparer un bécher rempli d'une solution désinfectante de qualité biologique et placer le bécher dans le capot.
    6. Remplir un bécher avec 100 ml de solution stérile CaCl2 (aqueous) et ajouter un agitateur magnétique. Définir la vitesse d'agitation à 100 tr/min. Placer le bécher sur une plate-forme magnétique à une hauteur de 18 cm de l'extrémité de la buse. Ce bécher sera utilisé pour recueillir les perles d'alginate et permettre leur gelation.
  2. Préparer les cellules pour l'encapsulation.
    1. Retirer les cellules de l'incubateur et se détacher du flacon proche du confluent à l'aide de la solution trypsine-EDTA de 0,25 % et incuber à 37 oC pendant 5 à 10 min.
    2. Isoler un échantillon pour l'estimation de la densité cellulaire, puis centrifuger les cellules restantes à 1 000 tr/min pendant 5 min pour obtenir une pastille cellulaire.
    3. Resuspendre la pastille dans HBS (20 mM HEPES et 150 mM NaCl) pour doubler la concentration cellulaire désirée finale (par exemple, pour une concentration finale de 1,5 x 106 cellules/mL, resuspendre les cellules dans HBS pour atteindre une concentration de 3 x 106 cellules/mL).
    4. Dans un tube de centrifugeuse de 50 ml, mélanger la suspension cellulaire dans un rapport de 1:1 avec une solution d'alginate de 4 % (w/v) pour obtenir une suspension finale contenant la concentration cellulaire désirée (p. ex., 1,5 x 106 cellules/mL) dans une solution d'alginate de 2 % (w/v).
  3. Définir les paramètres d'encapsulation.
    1. Définir la vitesse de la machine d'encapsulator à la vitesse maximale d'extrusion (8,9 mL/min), la tension à 1,0 kV et la fréquence à 5 500 Hz.
      REMARQUE : Ces paramètres ont déjà été optimisés pour obtenir des microbilles de 550 m de diamètre.

3. Fabrication

  1. Fabriquez les microbilles.
    1. Dans une seringue de 20 ml, chargez 5 ml de la suspension de cellules-alginates et attachez une seringue à l'encapsulateur.
    2. Démarrez l'encapsulateur en activant le flux qui poussera la suspension de cellules-alginates à travers la mangeoire. Un jet de gouttelettes sera extrudé à travers la buse.
    3. Recueillir le premier 1 ml dans le bécher pour vider le flux initial non uniforme.
    4. Continuer à courir les 4 ml restants permettant aux gouttelettes de tomber dans le bain de gel caCl 2. Chaque millilitre peut être exécuté séparément (mais successivement) et recueilli dans quatre bains de gélification différents si nécessaire.
      REMARQUE : Au contact du bain de gelation, l'alginate dans les gouttelettes se croisera instantanément avec les ions de calcium dans le bain de gelation et formera des microbilles sphériques.
    5. Après une minute, retirer le bécher de généalogie de la plate-forme magnétique et laisser reposer les microbilles pendant 4 minutes supplémentaires sans agitation (temps nécessaire pour permettre une gelation complète sur les microbilles à température ambiante).
  2. Récupérer les microbilles.
    1. Enlevez tous les gros débris ou objets d'alginate à l'aide d'une pince stérile, puis utilisez une pipette en plastique stérile pour transférer dans un filtre à mailles de 74 m pour récupérer les microbilles du bain de gélification.
    2. Transférer les microbilles dans un tube de centrifugeuse à l'aide du milieu de culture approprié et laisser l'équilibre pendant 5 minutes dans le milieu de culture cellulaire.
    3. Transférer dans un flacon, une assiette ou un plat Petri pour l'incubation et d'autres expériences.
      REMARQUE : Le bain de gel ne doit pas être réutilisé.

4. Test et utilisation de microbilles

  1. Testez la qualité des microbilles.
    1. Pour évaluer la viabilité des cellules (ou d'autres lectures biologiques) après l'encapsulation et la culture, perturber doucement les microbilles pour libérer les cellules encapsulées à l'aide du mélange de dissolution.
      REMARQUE : Le volume requis du mélange de dissolution dépend du nombre de microbilles utilisées par essai. Une ration suggérée est de 4 ml de mélange de dissolution pour chaque 1 ml de cellules encapsulées. Cette étape ne doit être effectuée que sur un seul échantillon de chaque population de microbilles.
    2. Incuber les cellules dans un incubateur de culture cellulaire complété par 5% de CO2 à 37 oC pendant 10 min.
    3. Estimer la viabilité cellulaire des cellules maintenant en solution comme d'habitude en taclant les cellules avec le bleu trypan et en utilisant une chambre d'hémocytomètre.
      REMARQUE : Si vous utilisez des compteurs cellulaires automatisés pour estimer la viabilité des cellules, il faut veiller à éviter que les artefacts d'alginate n'interfèrent avec les dénombrements. Dans ces cas, le comptage des cellules nauales est conseillé.
    4. Pour évaluer la stabilité des microbilles, mesurez le diamètre moyen d'un échantillon de chaque population de microbilles au cours d'un cours de temps à l'aide d'un microscope et d'un logiciel d'imagerie. Des variations ultérieures dramatiques de diamètre peuvent être indicatives de la dégradation de l'alginate.
  2. Utilisez des microbilles pour la détection de l'A sécrété.
    1. Échantillondez les supports de culture cellulaire à partir de cellules 7PA2 cultivées dans des conditions standard (2D) à 24 h d'intervalle et entreposez-les à -20 oC pour une analyse plus approfondie.
    2. Échantillondez les supports de culture cellulaire à partir de cellules 7PA2 encapsulées cultivées dans des conditions standard (3D) à intervalles de 24 h et entreposez à -20 oC pour une analyse plus approfondie.
    3. Détecter la sécrétion de cellules 7PA2 dans les médias conditionnés collectés par l'analyse immunosorbent liée aux enzymes (ELISA) (Figure 4).
  3. Utilisez les microbilles pour une étude plus approfondie dans les applications pertinentes.
    REMARQUE : Les cellules 7PA2 encapsulées peuvent être utilisées pour évaluer les effets de la sécrétion soutenue de l'A dans n'importe quel modèle ou modèle.
    1. Pour l'engraftment des microbilles dans l'hippocampe de rat dans les cerveaux, générer des sections coronales de 1 mm d'épaisseur du cerveau du rat et utiliser des outils chirurgicaux pour insérer des microbilles dans la zone désirée (Figure 5).
    2. Encapsuler différents types de cellules dans les microbilles d'alginate suivant les protocoles décrits pour évaluer la libération soutenue des biomolécules d'intérêt. Les systèmes in vitro et in vivo pertinents peuvent être modélisés.
    3. Détecter l'expression de marqueurs membranaires des cellules encapsulées à l'aide de cytométrie du débit et/ou d'immunofluorescence.
      REMARQUE: Un exemple de l'utilisation d'une méthode similaire pour la fabrication de microbilles modélisant les premiers stades de la croissance de masse tumorale et l'expression des biomarqueurs est décrit par Rios 20.

Representative Results

Les cellules 7PA2 sont encapsulées avec succès dans les microbilles d'alginate
Après la préparation, des microbilles d'alginate uniformes et sphériques sont générées avec succès à l'aide de ce protocole. Les images de la figure 2A ci-dessous montrent un exemple de la façon dont la modification d'un des paramètres (c.-à-d. la tension) modifie le débit et la dispersion du flux de gouttelettes d'alginate. Figure 2 B montre un exemple de perles d'alginate obtenues immédiatement après le processus de gelation.

Figure 2
Figure 2 : Optimisation de la méthode de fabrication. (A) Photographies montrant des changements dans la dispersion des cours d'eau. (B) Image de champ lumineux montrant des microbilles sphériques alginates immédiatement après la fabrication. (C) Exemple d'étape d'optimisation : tuning des paramètres de fabrication sélectionnés pour atteindre la taille cible des microbilles. Graphiques sélectionnés pour illustrer la relation entre chaque paramètre et la taille des microbilles qui en résultent (distribution de taille d'au moins 100 microbilles). Notez que le diamètre interne de la buse, la viscosité de la solution éjectée et les conditions de gélification peuvent également influencer la taille des perles fabriquées. Les barres d'erreur représentent S.D. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Le protocole décrit est flexible et permet la fabrication de différentes tailles de microbilles à base d'alginate, dont la composition varie selon l'application. Dans la figure 2C, nous rapportons l'influence du débit d'alginate, de la tension et de la fréquence sur la taille des microbilles à l'aide d'une solution d'alginate de 2 % (w/v) dans HEPES (pH 7.2) extrudée à travers une buse de 300 m.

Comme la portée de cette étude était de produire des microbilles qui peuvent être incorporées dans le cerveau du rat, nous avons ajusté les paramètres de fabrication pour obtenir un diamètre moyen de microbilles dans la gamme de 500-600 m. Aux fins du contrôle de la qualité, la méthode a été optimisée pour avoir une variabilité minimale entre la population de perles fabriquées (c.-à-d. distribution de taille étroite). Veuillez noter que (1) les perles produites peuvent être injectées dans le cerveau du rat à l'aide d'une seringue Hamilton équipée d'une aiguille de 20 G; et (2) un hémisphère du cerveau de rat peut accueillir jusqu'à deux ou trois perles de cette taille.

Après optimisation, encapsulant 7PA2 cellules à une concentration de 1,5 x 106 cellules/mL suspendues dans une solution d'alginate de 2% (w/v) tamponnée avec HEPES et tombée dans un bain de gérédulation de chlorure de calcium de 0,5 M a donné les microbilles désirées. Figure 3 A ci-dessous montre encapsulé 7PA2 cellules distribuées uniformément dans les microbilles après une journée dans des conditions de culture cellulaire standard. La prolifération des cellules 7PA2 a été testée à l'aide d'un test MTS selon le protocole du fabricant. Il n'y avait pas de différence significative entre le comportement des cellules 7PA2 cultivées avec ou sans alginate sur une période de sept jours (figure 3B). Lors de l'incubation des cellules encapsulées dans des conditions de culture standard, on s'attend à ce que les cellules continuent à proliférer pendant la durée de l'expérience, et de petits degrés d'évasion cellulaire peuvent être attendus en conséquence, comme indiqué dans d'autres travaux28. Les effets de ceci peuvent être atténués en encapsulant à une plus petite densité de cellules ou en réduisant la concentration de sérum dans laquelle les microbilles sont incubées.

Figure 3
Figure 3 : Cellules 7PA2 encapsulées. (A) Image de champ lumineux des cellules encapsulées de 7PA2 montrant même la distribution cellulaire dans tout le microbille d'alginate. Les paramètres de fabrication ont été fixés pour obtenir 150 cellules 7PA2 par perle. Aucune variation significative dans les perles d'alginate n'a été observée au cours de 7 jours de culture. (B) Il n'y avait aucune différence observée entre la prolifération globale des cellules 7PA2 incubées avec l'alginate par rapport aux cellules incubées sans alginate. Les cellules 7PA2 se développent et migrent à travers le volume des perles d'alginate; la réduction de la concentration de sérum peut être considérée pour ralentir la croissance de cellules. Les barres d'erreur représentent S.D. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Les microbilles d'alginate qui encapsulent les cellules 7PA2 sont stables au fil du temps
Pour étudier la taille et la forme des microbilles d'alginate obtenues, l'analyse de microscope a été exécutée après fabrication et gelation. Le diamètre moyen des microbilles obtenues à l'aide du protocole sélectionné est de 550 à 2 m.

Théoriquement, le nombre de cellules attendues dans un microbille de 550 m de diamètre peut être calculé comme suit :

Equation 1

où V et r rayon. Le volume d'une microbille unique est V 8,8 x 10-5 ml; par conséquent, le nombre de cellules par microbille au moment de l'encapsulation (1,5 à 106) x (8,8 x 10-5) - 130 cellules.

Expérimentalement, nous avons compté le nombre de cellules encapsulées immédiatement après la fabrication. Les perles d'alginate ont été doucement perturbées utilisant le mélange de dissolution et les cellules ont été souillées avec la solution bleue de trypan. L'estimation et le comptage de viabilité des cellules ont été exécutés utilisant un hémocytomètre ; les résultats obtenus ont montré une moyenne de 116 à 17 cellules vivantes par microbille (n à 5, données non rapportées). Comme prévu, une différence mineure entre le nombre théorique et expérimental de cellules immédiatement après l'encapsulation a été observée. Pour certaines applications, et en particulier pour déterminer la quantité de Libéré A au fil du temps, il est important de prédire le nombre de cellules encapsulées dans chaque perle d'alginate.

Fait intéressant, le processus d'encapsulation n'a pas d'impact significatif sur la viabilité cellulaire. Les résultats sont rapportés dans un travail précédent, dans lequel les cellules cancéreuses côlorectaux (c.-à-d., HCT-116) ont été encapsulées utilisant une méthode semblable, sans différences dans la viabilité cellulaire dans les microbilles d'alginate comparées aux contrôles 2D20.

Pour mesurer la stabilité de l'alginate utilisé dans le processus d'encapsulation, nous avons mesuré les diamètres des microbilles sur une période de 14 jours (n - 100). Il n'y a eu aucun changement observé dans le diamètre moyen 14 jours après l'encapsulation par rapport immédiatement après l'encapsulation (données non rapportées).

Les cellules 7PA2 encapsulées libèrent a au fil du temps
Les médias conditionnés analysés à partir de cultures 2D et 3D de cellules 7PA2 révèlent une augmentation constante des niveaux deA-1-42. Les supports de culture cellulaire ont été échantillonnés tous les 24 heures, et jusqu'à quatre jours, et analysés à l'aide d'ELISA. Nos données montrent que le taux de rejet de 1à 42 a d'a-42 à partir de microbilles (3D) est de profil similaire à celui publié par la culture 2D (figure 4).

Figure 4
Figure 4 : Taux de sécrétion de 1à 42 aétées à partir de cellules 7PA2. (A) Libération de l'A (% normalisée après 4 jours) à partir de modèles in vitro 2D et 3D a un profil similaire. Les deux modèles montrent une augmentation constante des niveaux de A au cours de la période de quatre jours et, comme prévu, une concentration constante n'est pas atteinte. (B) Concentration de A1-42 normalisée au nombre de cellules initiale, montrant une sécrétion similaire de A-1-42 au fil du temps, indépendamment des méthodes de culture. Ni la présence d'alginate ni le processus d'encapsulation (modèle in vitro 3D) ne modifient la sécrétion de l'A1-42. Les barres d'erreur représentent S.D. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Application potentielle de cellules 7PA2 encapsulées
Nous rapportons que les cellules 7PA2 encapsulées dans les microbilles d'alginate peuvent être utilisées efficacement pour la libération soutenue de a1-42, et donc utilisées pour tester l'effet de la sécrétion chronique de l'A dans n'importe quel modèle préclinique. Dans la figure 5 ci-dessous, nous montrons les avantages de l'utilisation de microbilles d'alginate qui peuvent être facilement injectées et situées dans le cerveau d'un rat. Les sections ex vivo sont ici utilisées à des fins d'illustration, comparant une perle d'alginate millimétrique par rapport à des microbilles d'alginate fabriquées.

Figure 5
Figure 5 : Utilisation de microbilles pour des applications précliniques pertinentes. Les microbilles pour l'engraftment dans le cerveau de rat doivent être assez petites pour être incorporées sans créer une lésion trop grande pour éviter des dommages au parenchyme de cerveau et affecter défavorablement le fonctionnement normal de cerveau. L'image (A) montre une comparaison de taille entre une perle à l'échelle millimétrique et une perle à l'échelle micrométrique côte à côte. (B) L'implantation d'une perle à l'échelle millimétrique dans le cerveau à des fins in vivo ne fonctionnerait pas. Image (C) montre une microbille fabriquée à l'aide de ce protocole. La taille est appropriée pour l'insertion dans l'hippocampe du rat sans avoir un effet préjudiciable sur la physiologie normale. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Les images ci-dessus soulignent l'importance de contrôler la taille de la microbille pour de telles études. Ici, nous démontrons l'avantage d'utiliser des microbilles de diamètres de moins de 600 m. Cela permet l'utilisation d'une injection mini-invasive (p. ex., seringue Hamilton) pour mieux contrôler l'emplacement des perles injectées dans le cerveau.

En résumé, l'encapsulation des cellules 7PA2 donne le contrôle sur la taille des microbilles, le nombre de cellules encapsulées et la prédiction de l'A sécrétée à partir des microbilles (p. ex. concentration, profil de libération). Le contrôle de la taille des microbilles est essentiel pour deux raisons : 1) pour permettre un contrôle affiné de la concentration de l'A libéré, et 2) pour permettre l'implantation dans une région contrôlée du cerveau du rat. Les résultats obtenus ici décrivent l'accord agefacile des microbilles d'alginate et mettent en évidence les applications potentielles pour d'autres études.

Discussion

La méthode décrite dans cet article est utile pour encapsuler les cellules réalisant une distribution de taille étroite des microbilles d'alginate27. Il offre également l'avantage de cultiver des cellules dans un environnement immuno-isolé17,19, les protégeant du stress externe. En outre, l'encapsulation des cellules dans l'alginate imite plus étroitement les conditions physiologiques, en particulier en ce qui concerne les interactions cellule-cellule et la rigidité de matrice20. Ces facteurs sont tous particulièrement cruciaux pour une utilisation ultérieure dans les applications pertinentes, telles que l'engraftment in vivo, empêchant les réactions immunitaires potentielles dans le tissu environnant17. En outre, un avantage majeur de ce protocole est la facilité d'aétibilité en fonction de l'application de l'intérêt: il est possible de modifier le protocole et d'optimiser les paramètres pour la fabrication de perles plus grandes ou plus petites, et plus doux ou plus rigides. La méthode décrite est utilisée pour fabriquer des perles assez petites pour être injectées avec des méthodes mini-invasives, et suffisamment grandes pour accueillir un certain nombre de cellules et fournir une libération suffisante de A pour avoir des effets comportementaux et pathologiques observables lors de l'injection dans les modèles animaux.

Le succès de ce protocole dépend d'un certain nombre d'étapes critiques. La manipulation soigneuse des cellules et les techniques optimales de culture cellulaire sont importantes pour maintenir la viabilité et la fonction cellulaires20,28. L'utilisation de conditions de culture standard assure la conservation du fonctionnement normal des cellules 7PA2, comme on l'observe. Cela permet un profil de libération similaire pour A1-42 à partir de cellules encapsulées par rapport aux cultures 2D. En outre, pour que le protocole fonctionne de manière optimale, une solution d'alginate à faible viscosité garantit de meilleurs résultats par rapport à une solution alginate à haute viscosité. Cela garantit qu'un jet laminaire homogène est extrudé par la buse et une distribution uniforme des cellules dans la matrice des perles fabriquées27. Les matériaux utilisés pour encapsuler les cellules doivent avoir un mécanisme de gélification très rapide, permettant la rétention de la forme.

Une autre étape critique dans ce protocole est la manipulation des microbilles fabriquées après la gélification. Ici, nous montrons la récupération des microbilles en utilisant une grande pipette en plastique d'ouverture pour transférer les perles. Alternativement, verser la solution de chlorure de calcium contenant les microbilles dans un filtre à mailles peut être utilisé pour la récupération de perles. Une grande pipette sérologique (5, 10 ou 25 ml) peut être utilisée pour dessiner les microbilles, puis lavée à travers le filtre à mailles au lieu de verser. L'avantage de ceci est une plus grande confiance dans la stérilité de la procédure comparée à verser. Cependant, les limites sont que certaines perles peuvent être déformées si elles sont comprimées par la pipette, en plus de risquer un rendement plus faible si une grande proportion de microbilles ne sont pas sauvés.

Cette approche a été utilisée pour encapsuler différentes lignées cellulaires afin de modéliser et d'étudier différentes maladies (p. ex., la libération d'insuline provenant d'îns pancréatiques encapsulés). La nouveauté de notre approche est l'engraftment des microbilles générées en utilisant ce protocole comme méthode utile dans la modélisation des aspects importants de la maladie d'Alzheimer in vivo. En comparant le profil de libération des cellules encapsulées (Figure 4) aux niveaux de A ' générés par une injection de bolus (comme celle rapportée dans d'autres études3,26), une libération plus chronique et soutenue de A peut être Attendu. La figure 6 illustre la tendance prévue qui peut être atteinte. L'utilisation de ce système pour la modélisation in vivo est plus pertinente pour la façon dont la maladie progresse et peut être plus utile dans la découverte et le développement de médicaments.

Figure 6
Figure 6 : Profil de libération prévu de a 1-42 à partir de cellules 7PA2 encapsulées par rapport à une injection de bolus. Le profil de la libération de l'A mD provenant de microbilles contenant 7PA2 greffées permet de tester les effets de l'A chronique et de l'A soutenue dans un modèle animal de pertinence pour la MA. Inversement, une injection de bolus créerait un pic dans les niveaux de A sur une courte période de temps, suivie d'un dégagement rapide de A du cerveau. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Les auteurs tient à remercier M. Kajen Suresparan, le Dr Jonathan Wubetu, M. Dominik Grudzinski, Mlle Chen Zhao et le Dr Thierry Pilot pour leur aide dans l'optimisation de la fabrication de microbilles d'alginate, de la culture cellulaire et de la détection a Discussions.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
µManager software Vale Lab, UCSF, USA v.1.46
0.22 um PES filter Merck, UK SLGP033RS
15mm Netwell insert 74 um mesh filter Constar, usa #3477
Alginic acid sodium salt from brown algae Sigma-Aldrich,uk A0682
Calcium chloride Sigma-Aldrich,uk C1016
CellTiter96  AQueous One Solution cell proliferation assay Promega, USA G3580
Encapsulator Inotech IE-50 serial no. 05.002.01-2005
HEPES Sigma-Aldrich,uk H4024
Hu Aβ 1-42 ELISA ThermoFisher, UK KHB3441
ImageJ software ImageJ v1.49p
Inverted light microscope Olympus CKX41
Leica microscope Leica microsystems, UK DMI6000B
Neo sCMOS Camera Ander, UK 5.5
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich,uk D1408
Sodium chloride Sigma-Aldrich,uk 433209
Trispdium citrate dihydrate Sigma-Aldrich,uk W302600-K
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich,uk T4049

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References

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Biologie Numéro 149 Maladie d'Alzheimer amyloïde A hydrogels alginate encapsulation modèles in vitro 3D libération contrôlée
Fabrication de microbilles d'amyloïde-Sécrétion d'alginate pour l'utilisation dans la modélisation de la maladie d'Alzheimer
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Almari, B., Brough, D., Harte, M., Tirella, A. Fabrication of Amyloid-β-Secreting Alginate Microbeads for Use in Modelling Alzheimer's Disease. J. Vis. Exp. (149), e59597, doi:10.3791/59597 (2019).

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